关键词： AZD1775   AZD6738   ATR   WEE1   三阴性乳腺癌   协同致死性  

摘要： 一、背景与目的 三阴性乳腺癌（Triple-negative Breast Cancer,TNBC）是指雌激素受体（Estrogen receptor,ER）、孕激素受体（Progesterone receptor,PR）和人类表皮生长因子受体 2（Human epidermal growth factor receptor 2,HER-2）均无表达的一类乳腺癌,是所有乳腺癌类型中恶性程度最高、预后最差的亚型。TNBC对内分泌治疗和抗HER2治疗多无效,且传统化疗治疗TNBC效果并不理想,因此现阶段探索针对TNBC的新兴疗法是乳腺癌研究的重点和难点。大多数TNBC都存在p53突变,意味着细胞G1期检查点失活,使细胞更依赖于G2/M期检查点来监控DNA损伤。研究表明,WEE1激酶和ATR激酶在G2/M期检查点和DNA损伤反应（DNAdamge response,DDR）中发挥着重要作用。本研究旨在探究WEE1抑制剂AZD1775联合ATR抑制剂AZD6738在TNBC中的抗肿瘤活性。通过体内外模型证实AZD1775和AZD6738的协同抗TNBC作用,并通过免疫印迹、免疫荧光和裸鼠皮下移植瘤模型等手段阐明AZD1775和AZD6738协同致死性的分子机制。从而为临床治疗TNBC提供新的手段。二、材料与方法1.探究AZD1775对TNBC细胞的影响用AZD1775处理7种TNBC细胞系,CCK8法检测TNBC细胞对AZD1775的敏感性。Western blot 检测 AZD1775 处理 TNBC 细胞 MDA-231 和 Hs578t后,对DDR相关蛋白、cleaved-caspase-3和pHH3表达的影响。2.比较ATR抑制剂、ATM抑制剂和DNA-PKcs抑制剂与AZD1775联用的效果用ATR抑制剂AZD6738、ATM抑制剂KU-60019或DNK-PKcs抑制剂NU7441和AZD1775联合运用处理MDA-231和Hs578t,CCK8法检测细胞活力比较三种联合方案抗增殖效果。3.检测AZD1775和AZD6738的协同作用AZD6738处理7种TNBC细胞系后,CCK8法检测TNBC细胞对AZD1775的敏感性。运用CCK8和细胞克隆形成实验在TNBC细胞中检测AZD1775和AZD6738单药或联合的抗增殖能力。利用CompuSyn软件计算上述实验中AZD1775和AZD6738的联合指数（Combination Index,CI）。流式技术检测AZD1775和AZD6738单药或联合对细胞凋亡的影响。4.比较 AZD1775 和 AZD6738 在 MDA-231、Hs578t、MCF7 和 MCF10A 中的联合效果 两种浓度比（1:5或5:1）的AZD1775和AZD6738联合处理MDA-231、Hs578t、MCF7和MCF10A,CCK8法检测细胞活力后,运用CompuSyn软件计算在各个细胞中AZD1775和AZD6738的CI值。AZD1775和AZD6738单药或联合处理MDA-231、Hs578t、MCF7和MCF10A后,流式技术检测细胞周期的改变。5.检测AZD1775与AZD6738联合对细胞DNA损伤和复制压力的影响AZD1775 和 AZD6738 单药或联合处理 MDA-231 和 Hs578t 后,Western Blot检测DDR相关蛋白、cleaved-caspase-3和pHH3的表达情况;流式技术检测γH2AX表达的变化;免疫荧光检测γH2AX、pRPA32（S4/S8）、RAD51的表达情况。6.分析AZD1775与AZD6738联合对细胞有丝分裂的影响AZD1775和AZD6738单药或联合处理MDA-231和Hs578t后,流式技术检测单个细胞的γ H2AX和pHH3表达情况。免疫荧光检测pHH3和α-tubulin的表达变化并观察有丝分裂和细胞核的形态。7.探讨CDKs激酶对AZD1775与AZD6738联合效应的作用CDK1/2 抑制剂 Roscovitine 或 CDK4/6 抑制剂 Palbociclib 预先处理 MDA-231和Hs578t后,再用AZD1775和AZD6738联合处理细胞,CCK8法检测增殖情况,免疫荧光检测γH2AX和RAD51的表达变化。Roscovitine或Palbociclib预先处理MDA-231和Hs578t后,用两种浓度比（1:5或5:1）的AZD1775和AZD6738联合处理细胞,CCK8法检测细胞活力后,运用CompuSyn软件计算在预处理前后AZD1775和AZD6738的CI值。8.明确AZD1775和AZD6738与顺铂联用的效果AZD1775和AZD6738单药或联合与顺铂共同处理MDA-231和Hs5

关键词： 大麻叶泽兰   迈克尔反应受体分子   谷胱甘肽   超高效液相色谱-质谱联用技术   精准发现   STAT3特异性抑制剂   三阴性乳腺癌  

摘要： 研究目的迈克尔反应受体分子是一类含有由烯键或炔键与吸电子基团共轭相连形成的亲电共轭体系官能团的化合物,是一类重要的生理活性分子,它可以通过与蛋白质半胱氨酸或精氨酸残基的共价结合调节细胞内众多信号转导通路从而发挥其生物学活性及治疗作用。STAT3是信号转导转录活化蛋白家族的重要成员。激活的STAT3通过调控关键基因,刺激肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤微血管形成、促进肿瘤细胞转移、侵袭等,参与肿瘤的发生、发展。抑制STAT3的激活,能阻断与肿瘤发生、发展相关联的多条通路。STAT3小分子抑制剂已成为肿瘤化疗研究的热点之一。STAT3为三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)的重要生物标志物。一些STAT3抑制剂结构共同点是具有“α-β不饱和羰基或砜基等”基团,为迈克尔反应受体分子(Michael reaction acceptor,简称MRA)。MRA是一类在生物医药领域具有良好应用前景的有机小分子,MRA型STAT3特异性抑制剂已成为分子靶向抗TNBC药物研究的热点。本研究以谷胱甘肽(GSH)作为探针,运用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)快速发现菊科(Compositae)泽兰属(Eupatoritm L)植物大麻叶泽兰(Eupatorium cannabinum Linn.)中具有MRA型STAT3特异性抑制剂的化合物。在以GSH为探针的孵育实验研究指导下,依据UPLC-MS谱图,根据色谱峰消失或峰面积强弱变化及体外药效活性,判断在EEECL F4-F10中存在抗TNBC细胞的MRA型化合物,本研究利用中压柱层析色谱技术对EEECLF4-F10进行了分离、纯化,并运用HPLC分析所得流分,合并得到有效部位ECL MRAs,并对其进行了体外抑制TNBC细胞株的实验研究。为了进一步明确这些化合物的化学结构及生物活性,本研究应用硅胶柱层析、中压柱层析、高效液相色谱、超高效液相色谱、制备液相色谱等现代色谱技术研究ECL MRAs的化学成分,并利用1H NMR、13C NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、NOSEY、HR-ESI-MS、ESI-MS、IR等现代波谱技术鉴定解析化合物的化学结构,阐明有效部位ECL MRAs中化学成分的化学结构类别及主要化合物的化学结构;对分离得到的化合物,系统评价其体外对TNBC细胞的抑制作用。研究方法1、通过硅胶柱层析、中压柱层析、高效液相色谱、超高效液相色谱、制备液相色谱等现代色谱技术从ECL MRAs中分离、纯化化合物。2、利用 1H NMR、13C NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、NOSEY、HR-ESI-MS、ESI-MS、IR等现代波谱技术鉴定解析化合物的化学结构。3、STAT3荧光素酶报告基因检测筛选STAT3特异性抑制剂。4、MTT法研究化合物体外对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用。5、利用中压柱层析技术,对EEECLF4-F10进行分离、纯化。6、利用RP-HPLC对EEECL F4-F10进行分析,合并流分得到有效部位ECL MRAs。7、MTT法研究ECL MRAs体外对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用。研究结果1、运用现代色谱技术从ECL MRAs中分离纯化得到了 9个化合物。2、运用现代波谱技术鉴定所得到的9个化合物的化学结构,均为倍半萜类化合物,其中 3 个为新化合物,其化学结构分别为(3aR,4R,6Z,9S,10E,11aR)-9-((2-hydroxy-3-methyl-butanoyl)oxy)-6,10-dimethyl-3-methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-octahydrocyclodeca[b]furan-4-yl(E)-2-(acetoxymethyl)but-2-enoate(1);(3aR,4R,6Z,9S,10E,1 1aR)-9-hydroxy-6,10-dimethyl-3-methyl ene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,1 1a-octahydrocyclodeca[b]furan-4-yl(E)-2-(aceto-xymethyl)but-2-enoate(2);(3aS,4R,6Z,9R,10E,1 1aR)-9-hydroxy-6,10-dimethyl-3-methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,1 1a-octahydrocyclodeca[b]furan-4-yl(E)-2-(acetoxymethyl)but-2-enoate(3),分别命名为Eucannabnolide A-C;6个已知的倍半萜类化合物分别为hiyodorilactone B(4),9β-hydroxy-8β-O-tlgloyl

关键词： 可溶性PD-1   免疫逃逸   三阴性乳腺癌   细胞衰老   肿瘤疫苗  

摘要： 研究背景乳腺癌（breast carcinoma）是来源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤。根据流行病学研究,全球乳腺癌发病率逐年上升,在女性恶性肿瘤发病率中已跃居为首位,并且发病年龄趋向年轻化,严重危害女性生命健康。乳腺癌在病理分子水平上呈现高度异质性,其治疗也主要依据肿瘤分期及分子分型来决定。当前,乳腺癌具体治疗方法包含手术、放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗等。在多学科综合治疗下,乳腺癌患者预后有了大幅度提升。然而,对于三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）患者来说,现有的治疗手段依旧匮乏,患者在诊治后容易出现肿瘤复发与转移,往往预后较差。因此,探索新的治疗方法显得尤为重要。免疫疗法（immunotherapy）在2013年被“Science”杂志评为“十大科学突破之首”。在乳腺癌的防治中,免疫治疗也越来越受关注。基于肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）和宿主关系的研究,学者们发现肿瘤疫苗是一种能提高三阴性乳腺癌患者预后的潜在治疗方案。目前,肿瘤疫苗（tumorvaccine）形式有多种,如灭活的全细胞疫苗、蛋白/肽疫苗、DNA疫苗、基因工程改造疫苗等。临床试验或是基础研究中,大多数肿瘤疫苗抗肿瘤的效果表现一般。研究指出,造成疫苗效果不佳的原因有多种,其中一方面可能是由于疫苗抗原呈递及T细胞激活的过程中缺乏某些炎性、细胞因子的辅助或是在此过程中负性免疫调节机制的激活。因此,开发新型肿瘤疫苗以克服这些障碍是当前疫苗研究的热点。近年来有研究指出,在化疗或放疗干预下,肿瘤细胞自身能够分泌多种细胞炎性因子,激活机体的免疫功能,促进肿瘤细胞自身的清除。进一步的研究揭示了这种现象的本质。这是由于治疗诱导肿瘤细胞发生了加速性衰老（accelerated senescence）。肿瘤细胞衰老后从具有活性的增殖状态进入了不可逆的生长停滞状态,并且在形态和代谢发生了特征改变,如细胞生长停止、形态变不规则、胞内颗粒增多、产生衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）、分泌生长因子及炎性细胞因子等。衰老肿瘤细胞（senescence tumor cells,STC）不可逆停止生长,拥有大量肿瘤抗原,能分泌独特的刺激因子作用于机体免疫系统,这表明,它能克服疫苗所面临的辅助因子缺乏的障碍,具有作为新型疫苗的潜力,其抗肿瘤效应令人期待。肿瘤患者接受治疗会导致TME发生变化,肿瘤细胞免疫逃逸机制也会随之激活,进而削弱治疗的效果。PD-1/PD-L1是主要的免疫逃逸机制之一。在正常机体中,PD-1/PD-L1信号通路起着负性免疫调节作用,能维持免疫功能的平衡,避免自身免疫性疾病发生。而对于肿瘤细胞而言,该通路是其自我保护,防止被免疫细胞清除的防御机制。显然,肿瘤疫苗接种后会改变患者TME,PD-1/PD-L1通路激活后会阻碍肿瘤抗原呈递乃至T细胞活化,导致疫苗失效。这意味着衰老肿瘤细胞疫苗（senescence tumor cells vaccine,STC）也可能会面临该通路的限制,而阻断该通路或将恢复疫苗的疗效。大量的实验研究将疫苗与商业化的阻滞剂联合以克服PD-1/PD-L1通路带来的负性作用。但是,临床上,商业化抗体所带来的经济负担和药物副作用是患者长期难以承受的。有学者在系统性红斑狼疮、慢性肝炎等免疫系统过度激活的患者血液中,检测到了可溶性PD-1分子（solublePD-1,sPD-1）。sPD-1能通过封闭免疫细胞表面的PD-L1分子使机体免疫系统持续、过强激活。因此若STC自身能分泌sPD-1,开发成新型的STCV,这不仅克服了疫苗上述所提及的障碍,还能减轻患者负担,值得我们去深入探讨。研究目的1.利用X线照射或不同浓度的干扰素γ刺激小鼠三阴性乳腺癌细胞株4T1,检测PD-L1分子的表达情况,明确治疗或肿瘤微环境调整是否会引起4T1细胞免疫逃逸。2.构建能稳定分泌可溶性PD-1分子的4T1细胞株及阴性对照细胞株,分别标记为4T1/sPD-1、4T1/NC,并探讨慢病毒感染、sPD-1的表达是否对肿瘤细胞性质造成影响。3.X线照射联合PARP抑制剂Veliparib在体外诱导4T1、4T1/NC、4T1/sPD-1细胞发生衰老,通过检测衰老相关β-半乳糖苷酶、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的表达确定细胞衰老状态。同时用ELISA检测衰老前后细胞分泌表型的变化,揭示其作为疫苗的潜能。4.将衰老4T1、4T1/NC、4T1/sPD-1细胞制备成疫苗对小鼠进行接种,观察疫苗本身的致瘤性,研究小鼠外周血、脾中免疫细胞变化,探讨sPD-1是否能增强STCV的安全性及其机制。5.诱导4T1、4T1/NC、4T1/

关键词： 多柔比星   三阴性乳腺癌   乳腺肿瘤   纳米粒子  

摘要： 目的制备载多柔比星(Dox)聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸(PEG-PLGA)纳米胶束,并研究其抗三阴性乳腺癌作用。方法以D,L-丙交酯和乙交酯为原料,采用本体聚合法合成PEG-PLGA共聚物,通过透析法制备Dox-PEG-PLGA纳米胶束;核磁共振1HNMR对其结构进行表征;透射电子显微镜观察纳米粒形态;激光粒度仪测定平均粒径、粒径分布;紫外分光度法测定纳米粒的载药率、包封率及体外释放;MTT法评价Dox-PEG-PLGA对鼠TNBC细胞4T1的细胞毒性,并通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测药物内吞。结果制备的纳米胶束呈圆形,大小较为均一,平均粒径约为135 nm,载药率为(9.70±0.33)%,包封率为(71.63±1.33)%;且工艺重现性良好,在96 h下呈现缓慢释放。Dox和Dox-PEGPLGA 24 h半数抑制浓度(IC50)分别为2.355 428和14.446 3μg·mL^(-1)。结论 Dox-PEG-PLGA纳米胶束具有较小的粒径、良好的缓释性能并能显著提高抗肿瘤效能。

关键词： 黄芪解毒汤   三阴性乳腺癌   复发   转移  

摘要： 目的:观察黄芪解毒汤治疗三阴性乳腺癌的远期疗效(抗复发转移)。方法:本研究将符合纳入标准术后生存3年以上的60例三阴性乳腺癌患者根据其术后是否长期服用黄芪解毒汤分为治疗组和对照组,每组各30例。治疗组予基础治疗并加用黄芪解毒汤长期服用,对照组仅给予基础治疗。对比两组患者术后局部复发、远处转移率、总复发转移率及术后生活质量。结果:1两组局部复发率比较无统计学意义(P>0.05);两组远处转移率比较有统计学意义(P<0.05);两组总复发转移率比较有统计学意义(P<0.05);2两组患者3年内复发转移率进行比较P>0.05,差别无统计学意义;两组患者4年内复发转移率进行比较P<0.05,差别有统计学意义;两组患者5年内复发转移率进行比较P<0.05,差别有统计学意义;两组患者5年以上病例数量过少,复发转移率比较无统计学意义;平均复发转移时间的比较P<0.05差别有统计学意义。3两组患者在卡氏评分变化方面比较差别有统计学意义(P<0.05)。结论:1本研究表明黄芪解毒汤能够使得三阴性乳腺癌患者复发转移的风险降低,尤其是能够降低远处转移的风险。2黄芪解毒汤可以延缓三阴性乳腺癌术后复发转移的时间,尤其是术后4、5年的复发转移时间。3黄芪解毒汤可以有效提高卡氏评分,改善患者的生活质量。

关键词： 乳腺癌   放射性碘化标记   SPECT   细胞粘附分子-1   三阴性乳腺癌   乳腺癌分子分型  

摘要： 癌症已经成为全世界人类的最大致死原因,乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一,发生于上皮组织,发病率位居女性恶性肿瘤之首,全世界数百万妇女遭受着乳腺癌的折磨。乳腺癌是高度异质性的疾病,不同分子亚型的乳腺癌,其临床表现、预后和治疗效果都不尽相同。三阴性乳腺癌(TNBC)是一类特殊的乳腺癌,其雌激素受体(ER),孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)的表达阴性,同样也是一种分子异质性疾病。TNBC恶性程度高、易转移,加上缺乏针对性的治疗方案和特定的分子靶点,导致TNBC患者相比较其他亚型的乳腺癌患者,具有相对较差的预后和较高的死亡率。细胞间粘附分子1(ICAM-1)在乳腺癌进展和转移中起重要作用,其在TNBC细胞和组织中过表达,可能是TNBC诊断和治疗的潜在分子靶点。本研究以ICAM-1为研究对象,围绕如何针对TNBC中ICAM-1的活体无创检测,开展对ICAM-1具有靶向性的单克隆抗体放射性标记及生物评价研究。旨在制备一种新型的TNBC靶向的放射免疫探针,考察其在TNBC诊断与治疗的方面前景。在第二章中,我们对一系列人源乳腺癌细胞表面ICAM-1的表达进行了检测,流式细胞术结果显示,ICAM-1在非三阴性乳腺癌(non-TNBC)细胞(BT474和MCF-7)上表达阴性,在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞(MDA-MB-231和MDA-MB-453)上表达阳性,其阳性率显著高于non-TNBC细胞(BT474和MCF-7)(P<0.05)比non-TNBC细胞高出6-11倍。MDA-MB-231和MCF-7移植瘤组织免疫化学染色鉴定结果与细胞流式结果一致。在第三章中,我们对抗ICAM-1抗体进行了131I标记研究,成功制备稳定的131I-aICAM1探针,并对探针进行了一系列评价。131I-aICAMI的标记率>90%,放射化学纯度>99%,探针置于PBS和胎牛血清于室温条件下,放置2 d后放射化学纯度>80%,说明该标记物的体外稳定性较好。通过细胞饱和实验、细胞免疫荧光和组织放射自显影等手段对探针进行鉴定。该探针具有良好的免疫活性和特异性,能够和MDA-MB-231细胞上ICAM-1特异性结合且具有较高的亲和力(Kd =2.71 ± 0.20 nM)。在第四章中,我们对125I-aICAM1进行了体内SPECT显像研究。当抗体蛋白注射剂量为10 μg时,125I-aICAM1的体内SPECT显像效果最好。125I-aICAM1可以特异且有效地富集至MDA-MB-231移植瘤,显示出良好的肿瘤靶向性,其在正常器官快速清除并具有高的靶/非靶比值,在注射后48 h时,肿瘤清晰可见,随着时间的推移,肿瘤积累量增加。在注射后1、24、48、72和96 h时,肿瘤部位的摄取分别为 3.09 ± 0.09%ID/g、7.02 ± 0.99%ID/g、8.87 ± 0.92%ID/g、11.79 ± 2.15%ID/g 和 15.10 ± 1.40%ID/g。96 h 时肿瘤部位的摄取效果最佳,此时肿瘤/心脏、肿瘤/肝脏和肿瘤/肌肉比值分别为3.66 土 0.34、5.36± 0.50和29.70 ± 2.76。而作为对比的125I-mIgG,在注射后的所有时间点几乎没有观察到MDA-MB-231肿瘤的摄取。在第五章中,我们进行了放射免疫治疗研究,131I-aICAM1可以显著抑制MDA-MB-231肿瘤的生长。125I-aICAM1是使用SPECT检测体内ICAM-1表达的新型的强有力的示踪剂,该探针有望对乳腺癌的分子分型研究提供信息,进行三阴性乳腺癌非侵入性SPECT成像并同步指导131I-aICAM1放射免疫治疗。

关键词： 三阴性乳腺癌   术后复发转移   中医药治疗   药物配伍   临床疗效  

摘要： 目的:探求中医药提高早期三阴性乳腺癌术后三年无病生存率，降低复发转移的疗效，挖掘中医药治疗三阴性乳腺癌的经验，提取治疗原则，核心处方和药物配伍。<br>　　方法:采用单组临床试验目标值法，设置目标值为86.4％，收集早期的三阴性乳腺癌患者，进行中医辨证治疗，随访至其术后三年，观察其三年的无病生存率，并与目标值进行比较，此次实验共需纳入70例受试者。从门诊数据库中抽取70例受试者的治疗处方，建立数据库，用频数分析，Apriori算法和聚类分析挖掘治疗三阴性乳腺癌的核心处方，常用药性、归经和药物配伍。<br>　　结果:本次研究共纳入70例三阴性乳腺癌患者，全部为女性，平均年龄56.73岁，最大年龄81岁，最小年龄31岁;其中行乳腺癌改良根治术55例，乳腺保乳术9例，乳腺单纯切6例，右乳34例，左乳36例。病理类型为浸润性导管癌63例，其他恶性乳腺癌病理类型7例，Ⅰ期21例，Ⅱ期39例，Ⅲ期10例，淋巴结阳性者16例，淋巴结阴性者54例，中位随访时间为40个月，平均随访时间为47.13个月，发生肺转移2例，肝转移1例，骨转移2例，锁骨上淋巴转移2例，三年无进展生存率为94.3％，经统计分析得x2=1.92，P=0.0271(P＜0.05，95％CI:88.8％～99.7％)，差异有统计学意义。<br>　　数据挖掘共有1000张处方纳入到分析数据库，包含17949味，252种，44类中药，使用频率在50％以上的中药有白术、茯苓、石见穿、党参、莪术、龙葵、淫羊藿、半枝莲、首乌藤、合欢皮、百合11种中药。根据功效分类，使用频率最高的功效有清热解毒药、补气药、补阳药、补阴药等，252种中药共包含有平、温、寒、微寒、凉、微温、热、大热、大寒9种药性，其中寒性药（大寒、寒、微寒、凉）占比40.94％，温性药（大热、热、温、微温）占比30.23％，平性药占28.83％，252种中药共包含有甘、苦、辛、淡、咸、酸、微苦、涩、微甘、微辛、微涩11种药性，其中甘味(51.60％)、苦味(50.19％)、辛味(40.75％)药使用频率较高;252种中药的归经涉及全部12经脉:肝经(54.28％)、脾经(49.16％)、肺经(38.38％)、胃经(34.27％)、肾经(29.88％)、心经(24.74％)、大肠(7.35％)、胆经(6.18％)、膀胱经(2.71％)、小肠经(1.46％)、三焦经(0.72％)、心包经(0.66％)。根据频数分析和聚类分析，治疗三阴性乳腺癌的核心处方是白术、茯苓、石见穿、党参、莪术、龙葵、淫羊藿、半枝莲;关联规则及聚类分析显示针对三阴性乳腺癌兼症常用的药对有百合-知母、首乌藤-合欢皮、陈皮-半夏、苍术-厚朴、麦冬-五味子、柴胡-黄芩，三味药药组有首乌藤-合欢皮-黄连、首乌藤-合欢皮-磁石，四味药药组有首乌藤-合欢皮-百合-知母。<br>　　结论:中医药可以提高早期三阴性乳腺癌的三年无病生存率，其核心处方是白术、茯苓、石见穿、党参、莪术、龙葵、淫羊藿、半枝莲。组方以清热解毒药、补气药、补阳药、补阴药为主，药性平和，寒平温配伍均衡，寒性稍多，甘味、苦味、辛味药居多，药物多入肝经、脾经、肺经、胃经、肾经。根据关联规则和聚类分析可知，治疗三阴性乳腺癌兼证的常用药对有:夜交藤-合欢皮、百合-知母、苍术-厚朴、半夏-陈皮、麦冬-五味子、柴胡-黄芩，常用的药组有夜交藤-合欢皮-百合-知母。

关键词： 天然化合产物   Ilamycin E   三阴性乳腺癌   KLF5   EGR1   内质网应激  

摘要： 意义乳腺癌是世界范围内女性最为常见的恶性肿瘤,在女性因癌症致死原因中占据主导地位。三阴性乳腺癌(TNBC)定义为缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及人表皮生长因子受体2(HER2)基因的特殊乳腺癌亚型,占乳腺癌全部类型15-20%。TNBC具有高风险的转移与复发率,目前仍缺乏有效的治疗措施。天然化合产物Ilamycin家族,来源于海洋微生物次级代谢产物,其细胞毒活性从来没有被报道过。有初步研究结果显示,化合物Ilamycin具有抗肿瘤活性,但仍需进一步深入研究。方法***法检测细胞存活率,反映化合物Ilamycin E,F对乳腺癌细胞存活的影响。使用不同浓度 Ilamycin E,F 在 HCC 1806,HCC 1937,MDA-MB-468,MDA-MB-231,T47D,MCF7,SKBR3,BT474,MCF10A 细胞系验证效果,并进一步用SRB的方法测定每株细胞系准确的IC50。最后根据实验需要选出作为研究的代表细胞系,作为后续实验的材料。***检测细胞增殖为了检测Ilamycin E对细胞增殖的影响,以不同浓度Ilamycin E(0,10,20,30μM)处理 HCC1937 和 MDA-MB-468 细胞 24 小时,以 EPI(0.2μM)作为阳性对照,然后用Click-iT EdU试剂盒进行处理,最后封片拍照,所得结果用ImageJ和IPP软件处理,从每个处理结果中选择3张图片进行统计、处理,所得比值作为最后结果。3.细胞周期试验为了进一步分析Ilamycin E导致细胞存活抑制的主要方式,我们使用流式细胞仪检测化合物对细胞周期进程的影响。用IlamycinE不同浓度(0,10,20,30μM)处理HCC1937,MDA-MB-468细胞24小时,胰酶消化,75%乙醇4℃固定。最后以大约1x106个细胞用100 μl 0.6%NP40+1μl PI+1 μ1 RNase的比例配成体系,重悬细胞。染色处理,AccuriC6(BD)上机分析细胞周期,软件FlowJo分析统计结果。4.细胞凋亡分析为了检测化合物Ilamycin E对细胞凋亡的影响,我们使用Annexin V和PI双染流式细胞方法检测化合物Ilamycin E对细胞凋亡的影响。使用Ilamycin E不同浓度(0,10,20,30μM)处理HCC1937细胞24小时,处理MDA-MB-468细胞36小时,Annexin V和PI双染流式细胞仪上机检测、分析细胞凋亡情况。5.蛋白印迹检测周期和凋亡相关蛋白的改变,用以探索凋亡机制为了探讨细胞周期和凋亡改变的机制,我们做了大量蛋白筛查,使用不同浓度Ilamycin E(0,10,20,30μM)处理48小时或用30μM单浓度处理HCC1937,MDA-MB-468细胞不同时间,加细胞裂解液冰上裂解30min,离心,蛋白定量,然后加4×SDS Loading Buffer,98 ℃ 5min煮样变性,上样,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,转膜,抗体孵育14小时,二抗孵育2小时,曝光仪检测检测各个目标条带变化情况。使用Photoshop作图软件进行数据处理。6.数据处理为了保证数据的准确性,实验数据进行至少三次独立重复的验证。使用软件SPSS运算t检验进行显著性分析,P值<0.05则认为有显著性差异。流式结果使用FlowJo处理,柱形图和线形图使用GraphPad制作。Edu结果使用ImageJ,IPP进行重叠计数。结果***细胞存活率检测结果显示,化合物Ilamycin E对HCC 1806,HCC 1937,MDA-MB-468,MDA-MB-231,T47D,MCF7,SKBR3,BT474,MCF10A 细胞具有广泛的细胞毒活性,同时化合物Ilamycin F不具有或在所给有效剂量范围内不具有细胞毒活性。化合物IC50检测结果显示,Ilamycin E对细胞有效IC50分布为14.24-49.19μM,三阴性乳腺癌细胞HCC1937细胞系最为敏感,而人永生化乳腺上皮细胞MCF10A细胞系敏感性最差。化合物Ilamycin E与F的结果差异表明Ilamycin家族化合物细胞毒活性具有特定的化学基团,这为化合物的改造指明了方向。***细胞增殖实验结果显示,化合物Ilamycin E显著抑制三阴性乳腺癌细胞系HCC1937和MDA-MB-468的DNA合成,减少细胞分裂,证明细胞增殖受到抑制。因此,我们初步得出结论,即化合物Ilamycin E导致的细胞存活抑制部分归功于细胞增殖抑制。3.流式细胞周期检测结果显示,随着化合物Ilamycin E有效作用浓度的递增,Ilamycin E显著增加HCC1937和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌细胞G0/G1期细胞比例,并降低细

关键词： 冬凌草甲素衍生物   死亡受体5   三阴性乳腺癌   抗肿瘤作用  

摘要： 乳腺癌是乳腺上皮组织细胞恶性转化形成的肿瘤，是严重威胁女性身心健康的疾病。在女性肿瘤患者中，乳腺癌的的发病率位居首位，发病率逐年提高，并呈年轻化趋势。乳腺癌患者的死亡率仅次于肺癌。乳腺癌作为一种在分子分型、组织形态和临床表现等有很强异质性的疾病，备受关注。其中，恶性程度高且易复发的三阴性乳腺癌(TNBC)由于缺乏特异的诊断方法、治疗靶点和治疗方法，一直是乳腺癌领域亟待解决的难点问题。TNBC对内分泌治疗和靶向治疗不敏感，所以目前只能按常规化疗治疗。近年来，天然药物成分以其抗肿瘤独特的机制、显著的效果、毒副作用小的特点受到国内外学者广泛的关注。冬凌草（Rabdosia rubescens）是唇形科香茶菜属碎米桠种的草本植物。冬凌草甲素是其主要的有效成分之一。众多研究已经证明冬凌草甲素具有广泛抗炎、抗菌和抗肿瘤作用，包括对乳腺癌的抑制效果也很好。但因冬凌草甲素是萜类化合物，结构复杂、极性差、用药浓度高、生物利用度低等缺点，极大的限制了其作为临床抗肿瘤药物的开发和应用。\n 从药物植物中发掘先导化合物并加以改造合成新型衍生物是开发抗癌药物的新途径。本文以冬凌草甲素为先导化合物，设计合成多个结构新颖未见报道的新型衍生物。通过前期的筛选，发现2\'-正丁氨基噻唑并[4，5-a]-1-去氧冬凌草甲素，即CYD-6-28在体外能有效抑制TNBC细胞HCC1806和HCC1937的增殖，抑制作用比冬凌草甲素分别提高约17倍、6倍，具有明显的抗癌活性。进一步研究发现，CYD-6-28能够显著抑制TNBC的细胞DNA合成，并将细胞周期阻滞在G2/M期。更重要的是，CYD-6-28能明显诱导TNBC细胞发生凋亡。实验证明CYD-6-28能显著上调p21表达，激活Caspase-3、-7、-8及其底物PARP的切割，并下调Cyclin D1、FLIPL、 XIAP等蛋白的表达水平。CYD-6-28还能抑制细胞信号转导分子STAT3、AKT的激活，增强ERK的激活。 CYD-6-28诱导TNBC细胞凋亡的部分是通过诱导DR5的上调表达而实现的。体内实验证明，CYD-6-28能有效抑制荷瘤裸鼠乳腺癌细胞的生长，对实验动物的毒副作用小，用药安全性较高。\n 本项研究首次报道了冬凌草甲素新型衍生物CYD-6-28通过调控与细胞周期、凋亡相关蛋白的表达，明显抑制TNBC细胞的生长，诱导TNBC细胞凋亡。具有开发为治疗TNBC药物的潜力。CYD-6-28的结构新颖，极性提高，抗肿瘤作用优于冬凌草甲素。目前未见国内外的相似文献报道。该研究对进一步开发利用冬凌草甲素，开发植物来源的抗肿瘤药物，推动中医药现代化有着重要的科学意义。

关键词： 三阴性乳腺癌   ZCH646   高效液相色谱法   含量测定   稳定性   影响因素试验  

摘要： 目的采用HPLC法测定新型抗三阴性乳腺癌（TNBC）药物ZCH646原料药的含量,并考察其稳定性。方法色谱柱为Phenomenex Gemini C18（150 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为10 mmol·L-1乙酸铵缓冲盐-乙腈（45∶55,三乙胺调p H9.0）,检测波长272.4 nm,流速1.0 m L·min-1,柱温25℃。结果 ZCH646能与相邻杂质完全分离,1～100μg·m L-1ZCH646与峰面积的线性关系良好（r=0.9995）,检测限为20 ng·m L-1;低、中、高浓度的平均回收率和RSD分别为100.1%、99.7%、101.6%和0.81%、0.51%、1.24%;ZCH646在高温、高湿条件下稳定,强光照射条件下颜色略有变化。结论所用方法简便快速、专属性强、精密度高,适用于ZCH646的含量测定和稳定性研究。