关键词： 三阴性乳腺癌   中药   活性成分   中药复方   作用机制  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)作为乳腺癌的一种亚型,具有侵袭性强、复发转移率高等特点,严重威胁女性身心健康,由于缺乏明确的分子靶标,目前仍以化疗为主,但临床治愈率低。中药可通过多途径、多靶点抑制TNBC的生长、降低其复发转移率,具有独特的治疗优势。文章结合国内外的最新研究成果,对中药及其活性成分抗TNBC的作用及其机制进行综述,为中药新药的开发及临床应用提供参考。

关键词： Antimycin   MDA⁃MB⁃231   MCF⁃10A   IC50  

摘要： 研究Antimycin类天然产物对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231特异性生长抑制和杀伤作用.三种结构类似的天然产物Antimycin⁃1,⁃2和⁃3对MDA⁃MB⁃231细胞生长都有很强的抑制作用,其IC50分别为1.34±0.07,160±20和180±50 nmol·L^(-1),Antimycin⁃1活性是Antimycin⁃2和Antimycin⁃3的一百多倍.10 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1就可有效抑制MDA⁃MB⁃231细胞增殖,药物处理细胞24和48 h后的抑制率分别达到约80%和90%.显微镜下可以观察到,10和100 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1都不同程度地杀伤MDA⁃MB⁃231细胞,1000 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1甚至使细胞几乎消溶,只留下突起的核和胞质残骸.而同样浓度药物造成的乳腺正常细胞MCF⁃10A和结肠癌细胞HCT116形态的改变不明显.1和5 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1对细胞集落抑制率分别达到52%和95%.20和50 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1也明显改变MDA⁃MB⁃231细胞核形态,核呈畸形,皱缩严重,核膜破损.5,10和100 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1处理MDA⁃MB⁃231细胞12,24和48 h引发细胞凋亡和坏死数量增加,并呈现时间和剂量依赖性.5,10和20 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1处理MDA⁃MB⁃231细胞6,12和24 h后,没有观察到对细胞周期时相的明显影响.20 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1处理MDA⁃MB⁃231细胞12,16,20和24 h后,引起胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平随处理时间延长呈逐渐下降趋势.以上结果证明,纳摩尔级的Antimycin⁃1能有效抑制和杀伤三阴性乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞.

关键词： VSP-17   三阴性乳腺癌   PPARγ   AMPK   EMT过程  

摘要： 目的:探讨新型PPARγ激动剂VSP-17对PPARγ信号通路的激活作用和对三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）转移的抑制作用及其潜在的作用机制。方法:（1）使用PBS重悬MDA-MB-231细胞,并将细胞悬液注射至雌性裸小鼠左右乳房的脂肪垫中,建立MDA-MB-231异种移植模型,两周后分别口服给药VSP-17（20 mg/kg）或罗格列酮（20 mg/kg）,七周后解剖小鼠并提取原位肿瘤的RNA,同时提取经过VSP-17（1,3,10μM）或ROS（1μM）处理后的MDA-MB-231细胞中的RNA,使用RT-q PCR分别对原位肿瘤和细胞中的PPARγ靶基因CD36的表达进行分析;荧光素酶报告基因检测VSP-17（10μM）或ROS（1μM）对PPARγ报告基因活性的影响;TR-FRET竞争性结合测试VSP-17或ROS与PPARγ的结合能力（2）以人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞为研究对象,使用VSP-17（0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30,100μM）培养细胞24 h后,加入MTT试剂检测细胞活性并筛选出合适的给药浓度;根据MTT试验的结果,使用VSP-17（1,3,10μM）或ROS（1μM）处理MDA-MB-231细胞24 h后使用RT-q PCR法检测细胞中肿瘤转移相关因子:BRMS1、E-cadherin、CXCL-12、MMP9、Orai1、Stim1、TGF-β和VEGF的表达;细胞迁移和侵袭试验用于检测VSP-17抑制MDAMB-231细胞转移的能力。以MDA-MB-231异种移植模型为研究对象,提取原位肿瘤的RNA并对相关因子的表达进行测定;对肝脏进行H＆E染色,分析VSP-17（20 mg/kg）和ROS（20 mg/kg）对肿瘤细胞肝脏转移的影响。（3）以人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞为研究对象,使用Western blot检测VSP-17（1,3,10μM）对三阴性乳腺癌细胞系中腺苷酸活化蛋白激酶AMPK信号通路的激活作用;使用AMPK抑制剂compound C（1μM）或si AMPK和/或VSP-17（10μM）处理MDA-MB-231细胞和MDAMB-453细胞,细胞迁移和侵袭试验检测AMPK信号通路对VSP-17抗迁移和侵袭作用的影响;Western blot和免疫荧光试验用于检测AMPK信号通路对VSP-17抑制EMT过程的影响;RT-q PCR用于测定AMPK信号通路抑制后,VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中E-cadherin m RNA表达的影响。使用PPARγ抑制剂GW9662（1μM）或si PPARγ和/或VSP-17（10μM）处理MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞,使用Western blot检测PPARγ对VSP-17对激活AMPK信号通路的影响;另外使用迁移和侵袭试验、Western blot、RT-q PCR和免疫荧光试验检测PPARγ信号通路对VSP-17抗转移作用的影响。结果:（1）VSP-17升高了MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231异种移植小鼠原位肿瘤中CD36的m RNA表达。（2）VSP-17升高了PPARγ报告基因的活性。（3）VSP-17与PPARγ的结合动力学抑制常数（Kinetic inhibition constant,Ki）为0.27。（4）VSP-17升高了MDAMB-231异种移植小鼠原位肿瘤中E-cadherin的m RNA表达。（5）VSP-17抑制了MDA-MB-231异种移植小鼠肿瘤细胞的肝转移。（6）VSP-17抑制了MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。（7）VSP-17升高了MDA-MB-231细胞中E-cadherin的m RNA表达。（8）VSP-17升高了MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中AMPK的磷酸化水平。（9）AMPK信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的抑制作用。（10）AMPK信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中EMT过程的影响。（11）PPARγ信号通路的抑制逆转了VSP-17升高MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中AMPK磷酸化水平的作用。（12）PPARγ信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的抑制作用。（13）PPARγ信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中EMT过程的影响。结论:（1）VSP-1

关键词： 三阴性乳腺癌   Beclin-1   小分子激动剂   自噬   凋亡  

摘要： 细胞自噬(Autophagy)是一种进化上保守的溶酶体降解途径,在细胞内环境稳态、细胞发育、细胞免疫、能量代谢、抑制肿瘤、预防神经退行性病变和延长寿命方面起着至关重要的作用。细胞自噬的药理学激活可能是治疗乳腺癌等人类癌症的有效方法之一。Beclin-1是自噬过程中的关键调控蛋白,作为III型磷脂酰肌醇3-激酶(class III phosphatidylinositol 3-kinase,PI3KC3)复合体的关键亚基调节自噬过程中关键的限速步骤。作为肿瘤抑制因子,BECN1基因的单等位基因缺失与多种癌症相关,因此Beclin-1是包括乳腺癌在内的多种癌症的潜在治疗靶点。然而由于其BH3(Bcl-2-homology-3)结构域,CCD(Coiled coil domain)结构域为螺旋结构,ECD(Evolutionary conserved domain)结构域的可药口袋浅,Beclin-1与PI3KC3复合体的人源高分率的结构信息尚未解析等原因,Beclin-1的靶向药物设计比较困难。本研究基于Beclin-1已有的晶体结构,分析其在形成PI3KC3复合体过程中的结构变化过程和关键的蛋白质相互作用界面。利用多种变构位点识别方法在其ECD结构域表征了一个潜在的变构位点。进一步采用分子对接的高通量虚拟筛选方法将SPECS库中的小分子化合物对接到变构位点,筛选候选的小分子激动剂。经过三轮的分子对接筛选,挑选了32个化合物作为候选的小分子激动剂。通过对细胞水平的自噬激活活性筛选和抗乳腺癌细胞增殖活性筛选,我们发现化合物10能够诱导乳腺癌细胞自噬,上调Beclin-1的水平。同时对MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-468,BT-549细胞都具有较好的抗增殖活性,对MDA-MB-231细胞尤为明显(IC=15.22μmol·L)。我们发现化合物10能够完美的对接到变构位点中,并且形成了稳定的相互作用。分子动力学模拟结果表明化合物10-Beclin-1复合体是一个稳定的系统。体外机制研究表明,化合物10能够诱导MDA-MB-231细胞发生自噬相关性死亡。同时还发现化合物10激活自噬后,还伴随细胞凋亡的发生。本研究确定了候选化合物10作为开发有效的、具有选择性靶向Beclin-1激活细胞自噬的先导化合物,为进一步开发和优化用于临床治疗的靶向Beclin-1激活自噬小分子药物提供依据。

关键词： 三阴性乳腺癌   木犀草素   上皮间质转化   Hippo-YAP/TAZ信号通路  

摘要： 目的:三阴性乳腺癌（TNBC）是所有乳腺癌中恶性程度最高的一种亚型,现有的内分泌治疗和靶向治疗对TNBC均无疗效,因此急需开发新的的治疗靶点和药物。Hippo-YAP/TAZ信号通路的异常激活与TNBC的发展和转移密切相关,我们前期研究从天然化合物文库中筛选YAP/TAZ抑制剂,发现木犀草素可以有效抑制YAP/TAZ的转录活性,本课题拟进一步探索木犀草素在TNBC细胞中抑制YAP/TAZ活性的作用与机制,为基于Hippo-YAP/TAZ通路抗三阴性乳腺癌的细胞增殖与转移的天然药物的研发提供参考。方法:（1）筛选调控TNBC细胞中Hippo-YAP/TAZ信号通路的小分子化合物:将MDA-MB-231细胞作为细胞模型,通过荧光素酶报告基因检测法筛选天然化合物文库,并发掘YAP/TAZ的潜在的抑制剂;利用RT-qPCR检测木犀草素对TNBC细胞中YAP/TAZ下游的两个基因CTGF和CYR61的mRNA水平的影响。（2）木犀草素对TNBC细胞的增殖抑制的检测方法:用SRB检测木犀草素（0-80 μM）对MCF10A、MDA-MB-231、4T1细胞的抑制率,在药物作用24h,48h,72h后测定并计算出药物半数抑制浓度;用细胞克隆形成法检测不同浓度的木犀草素作用于TNBC细胞,14天后计数不同药物浓度作用下的细胞克隆。（3）研究木犀草素抑制TNBC细胞增殖的作用机制:用免疫荧光染色观察木犀草素对TNBC细胞中YAP/TAZ的核定位的影响;通过RT-qPCR和WB检测木犀草素对TNBC细胞中Hippo-YAP/TAZ信号通路中主要分子的mRNA水平和蛋白水平的作用;分别构建MDA-MB-231细胞的过高表达TAZS89A细胞系和敲低TAZ细胞系,测定构建成功后的细胞系对木犀草素的敏感性;通过WB验证蛋白酶体抑制剂MG132逆转木犀草素对YAP/TAZ的抑制作用。（4）研究木犀草素抑制TNBC细胞的上皮间质转化（EMT）与迁移的作用机制:通过细胞划痕实验和Transwell实验检测木犀草素对TNBC细胞迁移能力的影响;利用RT-qPCR和WB检测木犀草素对TNBC细胞和过表达TAZS89A细胞中EMT相关标志物的mRNA水平和蛋白水平的影响。（5）验证木犀草素抑制TNBC细胞的体内增殖作用:将4T1细胞接种于裸鼠腋下,成瘤后随机分组,通过腹腔注射木犀草素干预实验组裸鼠移植瘤的生长,实验期测量小鼠体重和瘤体大小;用免疫组化检测木犀草素对小鼠移植瘤的YAP和TAZ的表达水平的影响。结果:（1）木犀草素是天然来源的YAP/TAZ抑制剂:我们利用荧光素酶报告基因检测了天然化合物文库中的木犀草素是YAP/TAZ潜在抑制剂;通过RT-qPCR检测出木犀草素可有效抑制TNBC细胞中YAP/TAZ下游的两个基因CTGF和CYR61的mRNA表达水平。（2）木犀草素可有效抑制TNBC细胞的增殖能力:用SRB检测木犀草素（0-80 μM）在MCF10A、MDA-MB-231、4T1细胞中24h,48h,72h的IC50值;相对于正常乳腺上皮细胞MCF10A,TNBC细胞对木犀草素比较敏感。木犀草素对TNBC细胞的抑制作用且与药物浓度和作用时间呈正相关;细胞克隆形成实验显示木犀草素能有效抑制TNBC细胞的克隆形成。（3）YAP/TAZ介导了木犀草素对TNBC细胞生长的抑制作用:木犀草素可降低TNBC细胞中YAP/TAZ的总体水平和核定位,并下调了 Hippo-YAP/TAZ下游分子的mRNA水平和蛋白水平。木犀草素对Hippo信号通路上游激酶无明显调控。MDA-MB-231高表达TAZS89A后出现药物抵抗,而MDA-MB-231细胞敲低TAZ后对木犀草素更敏感。木犀草素上调YAP/TAZ的磷酸化并促进pYAP/pTAZ以蛋白酶体途径降解。（4）木犀草素抑制TNBC细胞的EMT和迁移:细胞划痕实验和Transwell实验显示木犀草素减弱了 TNBC细胞迁移能力;RT-qPCR和WB证实了木犀草素通过下调TNBC细胞和MCF10A-TAZS89A细胞中间充质标志物的表达和上调上皮细胞标志物水平,从而实现了对TNBC细胞EMT的抑制和逆转。（5）木犀草素抑制TNBC细胞移植瘤的生长并降低YAP/TAZ的活性:木犀草素作用于实验组裸鼠18天后,实验组裸鼠移植瘤大小和重量均显著小于对照组,免疫组化结果显示实验组裸鼠移植瘤中YAP/TAZ的表达水平均明显低于对照组。结论:木犀草素可以降低YAP/TAZ的转录活性,并有效抑制TNBC的细胞增殖、EMT和迁移能力;木犀草素诱导YAP/TAZ磷酸化并促进pYAP/pTAZ以蛋白酶体途径降解;木犀草素可以抑制TNBC细胞移植瘤生长,并降低肿瘤组织中YAP/TAZ的蛋白表达水平。本文揭示了木犀草素靶向Hippo-YAP/TAZ

关键词： 白头翁皂苷A3   三阴性乳腺癌   M2型巨噬细胞   4T1-Luc三阴性乳腺癌肺转移模型  

摘要： 目的:本研究的目的旨在研究白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化发挥抗三阴性乳腺癌转移的作用。通过体外构建巨噬细胞M2极化模型,考察白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的影响及其作用机制;通过体外研究白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌迁移能力的影响,同时体内研究白头翁皂苷A3对4T1-Luc三阴性乳腺癌肺转移小鼠的抗转移作用及其机制,为治疗三阴性乳腺癌转移提供新的研究思路与实验根据。第一部分:白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的作用及其机制研究方法:本研究采用原代巨噬细胞BMDM来构建巨噬细胞M2型极化模型,以评价白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的影响。采用CCK-8法考察白头翁皂苷A3对BMDM细胞存活率的影响;采用流式细胞术考察白头翁皂苷A3对M2型巨噬细胞标志性抗原CD206表达的影响;采用RT-PCR法考察白头翁皂苷A3对M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平的影响;采用Western-blot检测白头翁皂苷A3对JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达水平的影响;采用分子对接方法预测白头翁皂苷A3抑制巨噬细胞M2型极化的作用靶标;采用si RNA转染BMDM细胞,将其STAT3基因敲低,加入白头翁皂苷A3干预后,RT-PCR法检测M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平。结果:CCK-8结果发现,白头翁皂苷A3在0-100μg/ml浓度范围内对BMDM细胞的存活率无明显影响;IL-4诱导BMDM细胞后,F4/80+CD206+双阳性比例从2.92%±0.09%上升到46.4%±1.72%（P＜0.01）,而同时给予低、高剂量的白头翁皂苷A3干预后,F4/80+CD206+双阳性比例从46.4%±1.72%分别下降至28.2%±0.92、17.6%±0.34（P＜0.01）;IL-4诱导BMDM细胞后,M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平显著上升（P＜0.01）,同时给予白头翁皂苷A3后,BMDM细胞内CD206、Arg-1、Fizz1、Ym1的m RNA表达水平显著降低（P＜0.01）;IL-4诱导BMDM细胞后,BMDM细胞内JAK2、STAT3蛋白磷酸化表达水平显著上调（P＜0.01）,同时给予白头翁皂苷A3干预后,BMDM细胞内JAK2蛋白磷酸化表达水平无明显变化,但同时给予白头翁皂苷A3组干预后,BMDM细胞内STAT3蛋白磷酸化表达水平显著降低（P＜0.05）;分子对接显示,白头翁皂苷A3与STAT3蛋白对接活性较好,STAT3可能为白头翁皂苷抑制巨噬细胞M2型极化的作用靶标;STAT3-si RNA转染BMDM细胞后,与IL-4-STAT3-si RNA组比较,IL-4+白头翁皂A3-STAT3-si RNA组M2型巨噬细胞标志性基因的m RNA表达显著下调（P＜0.01）。第二部分:白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌转移的影响方法:本研究通过体内外实验考察白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌转移的作用。体外实验中收集IL-4与白头翁皂苷A3单独或共同孵育巨噬细胞的条件培养基,将其作用于4T1细胞,通过Transwell小室迁移实验与细胞划痕实验考查其迁移运动能力,同时考察白头翁皂苷A3本身对4T1细胞迁移运动能力的影响;体内实验中构建4T1-Luc三阴性乳腺癌细胞Balb/c小鼠肺转移模型,采用小动物活体成像术及HE染色法观察小鼠三阴性乳腺癌肺转移情况,以考察白头翁皂苷A3体内抗三阴性乳腺癌转移的作用。采用免疫组织化学染色法测定肺组织中的巨噬细胞M2型极化相关表面抗原CD206的表达。结果:体外Transwell小室迁移实验结果表明,IL-4诱导的条件培养基能显著增加迁移至小室底部的4T1细胞数量,从每个视野109±15增加至231±32个（P＜0.01）,与IL-4诱导的条件培养基比较,同时给予高剂量的白头翁皂苷A3与IL-4孵育BMDM细胞得到的条件培养基能显著降低迁移至小室底部的4T1细胞数量,从每个视野231±32个分别下降至187±34个（P＜0.05）;细胞划痕实验发现,IL-4诱导的条件培养基能显著增加4T1细胞的划痕愈合能力（P＜0.01）,与IL-4诱导的条件培养基比较,同时给予高剂量的白头翁皂苷A3及IL-4孵育BMDM细胞得到的条件培养基能显著降低4T1细胞划痕愈合率（P＜0.05）;而白头翁皂苷A3本身对4T1细胞的迁移能力无明显影响。三阴性乳腺癌肺转移结果显示,经过白头翁皂苷A3干预后,与4T1-Luc乳腺癌肺转移模型组小鼠比较,白头翁皂苷A3高剂量组4T1-Luc小鼠体重显著

关键词： 熊果酸   三阴性乳腺癌   抗肿瘤   网络药理学   分子对接  

摘要： 目的:本研究运用系统生物信息学工具与网络药理学分析方法,以阐释熊果酸(Ursolic acid,UA)干预三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)的潜在分子机制及关键靶点,并通过体外实验进一步验证有效性,为UA作为中药天然化合物治疗TNBC提供药理学证据及新药研发指导。方法:***对TNBC细胞系功能学影响:通过CCK8法分别测试不同药物浓度下的UA干预TNBC细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468后细胞活力的变化。伤口愈合实验和体外侵袭实验分别检测不同浓度UA对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系迁移能力及侵袭能力产生的影响。流式细胞术检测被用来评估在接受不同浓度UA处理后MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞凋亡情况。***微阵列基因芯片获取和处理:运用R语言在GEO数据库下载TNBC相关芯片数据,并借助Rstudio中的“affy”软件包进行标准化处理。随后,使用“limma”语言包进行差异表达分析(differentially expressed genes analysis,DEGs)。DAVID数据库被用来对DEGs基因进行富集分析。同时,DEGs基因被导入STRING在线工具以构建蛋白质相互作用网络,最后,通过拓扑分析获得TNBC的候选靶点基因。3.分子对接,预后价值评估及GSEA富集分析:将本研究获得的TNBC候选差异基因与UA小分子化合物进行分子对接,通过对接打分,选择具有最高结合度的关键靶基因作为研究对象,并进行预后价值分析及GSEA富集分析。***对TNBC关键靶点的影响:通过实时荧光定量PCR及Western Blot分别检测不同浓度UA对TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468后关键靶点在转录和蛋白表达水平的影响。结果:1.本研究的细胞功能学实验显示,TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468经过UA处理后细胞增殖受到抑制,且具有时间和浓度依赖性(P<0.05);细胞伤口愈合实验和侵袭实验显示,UA可以显著TNBC细胞的迁移及侵袭能力(P<0.05);流式细胞术检测结果表明,经过UA处理后,TNBC细胞的凋亡百分比呈浓度依赖的方式显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.运用R语言在GEO数据库中筛选获得2张TNBC相关基因芯片GSE45827和GSE65194,整合并去除批次效应后进行差异表达分析,得到724个DEGs基因。根据靶点连通度(degree)最高等级进行的综合排名的拓扑分析结果,确定前15个DEGs基因作为进一步分析的候选靶基因,包括CDK1、CCNA2、CDC20、CCNB1、CCNB2、MAD2L1、AURKB、TOP2A、BUB1B、KIF11、PLK1、CDCA8、NCAPG、KIF2C和UBE2C。3.分子对接表明,在15个候选靶点与UA小分子化合物的对接结果中,PLK1(对接得分:5.9357)和CCNB1(对接得分:5.2448)与UA的结合度最佳,故PLK1和CCNB1被确定为关键靶点。预后分析显示,PLK1和CCNB1的高表达与患者不良预后呈负相关(P<0.05)。同时,GSEA富集结果显示,PLK1和CCNB1共同显著富集于P53信号通路,其中PLK1和CCNB1可能通过P53基因调控。因此,PLK1,CCNB1和P53被作为后续实验验证的核心靶点。4.实时荧光定量PCR和Western Blot检测显示,相较于空白对照组,经过UA处理后,TNBC细胞中PLK1和CCNB1的mRNA和蛋白表达均呈浓度依赖性降低,P53的mRNA和蛋白表达随着浓度增加而上调。差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究表明,UA作为中药天然化合物可以显著抑制TNBC细胞的增殖,迁移,侵袭并诱导细胞凋亡。其中UA干预TNBC的潜在分子机制可能涉及调控P53来影响PLK1和CCNB1的表达,从而在TNBC治疗中发挥关键作用。这些发现从系统的角度阐释了UA治疗TNBC的分子和药理机制,为UA通过多靶点干预TNBC提供了有力的证据。

关键词： 白皮杉醇   三阴性乳腺癌   抗肿瘤作用   抗血管生成   Wnt/β-Catenin信号通路  

摘要： 目的:探究白皮杉醇（Piceatannol,PIC）体外对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其抗血管生成作用,并基于Wnt/β-Catenin信号通路通过体内外实验探讨PIC对TNBC抗肿瘤作用的机制研究。方法:通过MTT实验考察PIC在不同浓度（0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160）μM对TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468增殖的影响及经VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖能力的影响;利用流式细胞术检测PIC对TNBC细胞周期和凋亡的影响;通过transwell invasion和划痕损伤修复实验观察PIC对MDA-MB-231、MDA-MB-468及VEGF诱导的HUVEC细胞侵袭和迁移能力的影响;通过小管生成和大鼠主动脉环实验考察PIC对VEGF诱导的HUVEC细胞小管生成和微血管出芽生成能力的影响;利用Western blot和免疫荧光实验探究PIC体外抗肿瘤作用机制;通过建立荷人乳腺癌（MDA-MB-231）裸鼠模型,利用免疫组化和免疫荧光实验进一步验证PIC抗肿瘤及抗血管生成作用及机制。结果:PIC可有效抑制TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的增殖,其IC分别为:74.98μM和26.36μM,并且能够明显的抑制VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖;与空白对照组进行比较,PIC能将MDA-MB-231细胞阻滞在G2/M期,MDA-MB-468细胞阻滞在G0/G1期,同时促进TNBC细胞的凋亡,在PIC高浓度作用48 h后,MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的凋亡率分别为24.40%和49.87%;PIC抑制TNBC和VEGF诱导的HUVEC细胞的侵袭与迁移能力及VEGF诱导的HUVEC细胞的小管形成和大鼠主动脉环出芽的微血管生成能力,PIC高浓度作用48 h,MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞和VEGF诱导的HUVEC细胞的侵袭能力的抑制率分别为:90.33%、60.33%和86.33%;Western blot实验结果表明,PIC能明显抑制TNBC细胞增殖、凋亡相关蛋白Akt、Erk1/2、p38MAPK蛋白磷酸化及Bcl-2蛋白表达,促进Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达,抑制VEGF诱导的HUVEC细胞中血管生成相关蛋白FAK、VECFR2蛋白磷酸化和VEGFA蛋白表达,减少Wnt/β-Catenin通路相关蛋白CD44、C-Myc、Survivin、VEGFA和β-Catenin蛋白表达,细胞免疫荧光和Western blot的实验结果一致,表明PIC能抑制TNBC细胞中β-Catenin蛋白表达。以上结果提示,PIC可有效抑制TNBC细胞中Wnt/β-Catenin信号通路激活,抑制肿瘤细胞增殖,且具有抑制血管生成的能力;裸鼠移植瘤实验结果表明,PIC对小鼠TNBC肿瘤的生长具有很好的抑制效果。免疫组化实验结果发现,PIC能减少肿瘤组织中Ki-67的表达量,减少细胞中β-Catenin累积,和细胞水平实验结果一致。通过免疫组化和免疫荧光实验结果发现,PIC能降低VEGFA和CD31的表达,表明PIC具有较强的抗血管生成的作用。结论:PIC通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路激活表现出良好的抗TNBC及抗血管生成活性,进一步确证了PIC具有良好的抗肿瘤作用。

关键词： 梅花参   三阴性乳腺癌   海参皂苷   丝裂原活化蛋白激酶  

摘要： 目的:从中药梅花参的次生代谢产物中发现抗乳腺肿瘤的活性三萜类皂苷化合物,鉴定其化学结构并研究其抗乳腺癌作用机制。方法:结合生物学与化学的技术和方法,开展中药梅花参来源的海参皂苷作用机理研究。采用活性追踪分离结合多维化学导向技术,快速定位目标皂苷分子;充分利用各种正反相硅胶柱色谱、凝胶色谱、制备HPLC等色谱分离方法,分离纯化获得海参皂苷单体;综合运用核磁共振波谱、高分辨质谱等方法,确定单体化合物的化学结构。继而以活性分子为生物体内探针,发现药物作用新靶标或新的作用机制,并在细胞水平上进行功能确证,研究海参皂苷化合物对乳腺癌细胞株MDA-MB-231等细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,以及该化合物对肿瘤细胞信号通路的影响和分子机制,从而探寻海参皂苷的抗肿瘤机制。结果:1.成功从采自中国南海西沙群岛的梅花参样品中分离并鉴定得到Stichoposide C2(STC2)、Stichoposide B1(STB1)、Stichoposide C1(STC1)、Stichoposide A(STA)四种具有抗肿瘤活性的三萜类皂苷化合物,选取其中对正常细胞毒性较小的STC2进行后续研究;***2能够较为显著地抑制MDA-MB-231和4T1两种乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,且呈剂量依赖性;***2能够诱导MDA-MB-231和4T1两种乳腺癌细胞的细胞周期阻滞,将其分别阻滞在G2/M期和S期,且能诱导两种乳腺癌细胞凋亡;***2能够诱导两种乳腺癌细胞的DNA损伤,显著增加其DNA双链断裂标志物γ-H2AX的蛋白表达水平;***2能够分别下调MDA-MB-231和4T1细胞的p-cdc2、Cyclin B1以及CDK2、Cyclin A2蛋白表达水平;STC2能够上调两种乳腺癌细胞的Bax、Cleaved PARP蛋白表达水平,能够上调MAPK信号通路相关蛋白p38、JNK、ERK1/2的磷酸化水平以及下调Akt的磷酸化水平,推测STC2的抗乳腺肿瘤活性可能与此有所关联。结论:中药梅花参中含有丰富的抗肿瘤活性皂苷产物,从中药梅花参中分离得到的海参皂苷化合物STC2能够对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的增殖形成抑制现象,对其细胞周期的阻滞以及细胞凋亡的发生也有着明显的诱导和促进作用,其作用机制可能与抑制细胞周期相关蛋白以及MAPK信号通路相关。

关键词： 三阴性乳腺癌   Antimycin   核损伤   K-Ras  

摘要： 背景:乳腺癌已成为全球最常见的癌症,其中三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是恶性程度最高的一种分型。由于TNBC缺少常用激素治疗的靶标,且具有异质性高、易转移、易耐药等特点,急需寻找明确有效的靶向治疗方法。天然化合物一直是抗癌小分子药物的重要来源,抗霉素(Antimycin)家族是由放线菌中分离得到的一类重要天然小分子化合物,近年来越来越多的研究开始关注它的抗肿瘤效果。研究发现Antimycin类化合物可以通过多种方式产生抗肿瘤活性,但目前缺少其对三阴性乳腺癌的作用效果及作用机制研究。有研究表明含3-甲酰基水杨酸基团的Antimycin类化合物可能通过抑制K-Ras膜定位而发挥抗肿瘤活性。Ras蛋白在维持细胞正常生长增殖等重要生理功能中起重要作用,Ras异常高表达可显著提升TNBC的耐药性,最常发生突变的Ras是K-Ras亚型。本实验室前期实验中筛选出三种抗霉素化合物,分别命名为Antimycin-1、Antimycin-2、Antimycin-3,它们均特异性的显著抑制三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-453)活力,其中尤以含3-甲酰基水杨酸基团的Antimycin-1的抑制作用最强,但具体药物作用机制仍需进一步探究。目的:本课题旨在明确前期实验中筛选得到的三种Antimycin类化合物对TNBC细胞的特异性杀伤作用,分析抑制作用最强的Antimycin-1对TNBC细胞功能的影响,并探索Antimycin-1抑制TNBC细胞的作用机制及其动物安全性。方法:1、通过CCK8检测三种Antimycin类药物对多种肿瘤细胞的抑制效果,观察药物对细胞形态和细胞骨架的影响,通过克隆形成实验检测和划痕实验分别检测低浓度的Antimycin-1对三阴性乳腺癌细胞克隆生成能力及迁移能力的影响。2、通过流式细胞术检测Antimycin-1处理三种三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)后,各细胞凋亡或坏死的比例及细胞周期时相的变化,通过q PCR检测细胞周期相关关键蛋白的基因水平变化。3、用20 nmol·L的Antimycin-1处理三种三阴性乳腺癌细胞后,使用流式细胞术检测细胞ROS水平的变化,使用免疫荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位水平变化,并通过激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化及DNA损伤情况。4、通过蛋白质免疫印迹实验检测Antimycin-1处理三阴性乳腺癌细胞后,细胞中Akt、Mek、Erk总蛋白及其相应蛋白磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平的变化。5、构建稳定表达外源e GFP-KRas蛋白的三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞株,观察Antimycin-1处理后K-Ras定位变化。6、给昆明小鼠隔日腹腔注射不同剂量的Antimycin-1,观察小鼠存活情况。分别使用Antimycin-1进行高剂量单次和低剂量多次的方式处理小鼠,取心、肝、脾、肺、肾组织并进行H&E染色,观察小鼠重要脏器损伤情况。7、所有实验重复三次,用Graph Prism8统计软件分析数据,使用Student’s t检验分析两组间差异,使用One-way ANOVA分析多组间差异,P<0.05时差异具有统计学意义。结果:1、Antimycin类药物特异性抑制三阴性乳腺癌细胞的活力:三种Antimycin类药物均特异性的显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,其中Antimycin-1的抑制效果最强,对三种三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的IC50(半数抑制浓度)均达到纳摩尔级别。Antimycin-1处理细胞后,对照细胞形态无明显改变,但三阴性乳腺癌细胞显著皱缩,细胞骨架也遭到明显破坏。同时,5 nmol·L的Antimycin-1即可显著抑制三阴性乳腺癌细胞的克隆生长能力与迁移能力。2、Antimycin-1影响三阴性乳腺癌细胞多种细胞功能:纳摩尔级浓度的Antimycin-1即可在短时间内引起三阴性乳腺癌细胞大量死亡,但对其细胞周期的影响不大。20 nmol·L的Antimycin-1处理4 h内,三阴性乳腺癌细胞已经出现明显的DNA损伤。同时Antimycin-1处理三阴性乳腺癌细胞24 h内其ROS水平保持不变或略有下降,处理20 h后线粒体膜电位才开始下降。3、Antimycin-1抑制三阴性乳腺癌细胞中K-Ras膜定位并降低K-Ras信号下游关键蛋白的磷酸化水平:20 nmol·L的Antimycin-1处理5 h内即可显著降低三阴性乳腺癌中K-Ras下游Akt、Mek、Erk蛋白的磷酸化水平。正常情况下K-Ras稳定分布于细胞膜上,