关键词： CA-4   三阴性乳腺癌   PI3K  

摘要： 目的 以CA-4为先导化合物,按照微管蛋白和PI3K双靶点活性进行设计、合成一种CA-4类衍生物[1-(3,5-二氟苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯]。并在人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞上进行PI3K活性初步研究。方法 采用MTT法测定IC50值,倒置显微镜观察细胞状态,流式细胞术检测细胞周期阻滞情况,AutodockTools系统进行衍生物和PI3K分子对接,ELISA法检测细胞上清液中PI3K分泌表达量,RT-PCR和Western blot分别检测PI3K mRNA和蛋白表达水平。结果 该衍生物对MDA-MB-231细胞的IC_(50)=5.78 μmol·L^(-1),使细胞内出现一系列凋亡形态变化,阻滞细胞生长周期于G_(2)期,与PI3K良好结合,结合自由能为-36.4008 kJ·mol^(-1),降低PI3K分泌量且下调PI3K的基因和蛋白表达水平。结论 该衍生物的PI3K靶点活性得到了初步验证,也可为此类化合物进一步机制研究提供参考。

关键词： RNA   三阴性乳腺癌   药物递送系统  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)作为最具侵袭性的乳腺癌亚型,具有复发率高、死亡率高、治疗方法少等特点。核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)疗法可高效地调控靶标基因及相关下游通路,与化疗药物等联合应用,能够显著改善TNBC治疗效果,对基因调控和疾病治疗有重要意义。然而,RNA作为药物易被核酸酶降解、易被免疫系统识别及难以进行跨膜运输,因此设计靶向药物递送系统是RNA药物开发的重要目标。通过对抗TNBC的RNA药物递送系统进行综述并对其未来发展方向进行展望,以期为RNA药物的研发提供参考,促进RNA药物临床转化。

关键词： 瑞香狼毒提取物   乳腺癌多药耐药   凋亡   Nrf2   抗氧化  

摘要： 该研究将探讨瑞香狼毒提取物(SCL)抑制乳腺癌多药耐药的作用及机制。实验以人三阴性乳腺癌细胞亲本株MDA-MB-231,及其阿霉素耐药细胞株MDA-MB-231/ADR为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力;DAPI染色和Annexin-V/Pi凋亡双染检测细胞凋亡,Western blot(WB)检测Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬酶(caspase)-9、caspase-3的表达水平,免疫荧光染色观察Nrf2细胞内分布,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平。实验结果显示SCL的耐药因子是0.69,对应地,阿霉素和紫杉醇的耐药因子分别是8.40、16.36;DAPI染色结果显示SCL能够导致乳腺癌细胞核皱缩、碎裂;Annexin-V/Pi凋亡双染显示,在中、高剂量SCL的作用下,耐药细胞的平均凋亡率分别为32.64%、50.29%;WB检测结果提示:SCL能够明显降低抗凋亡蛋白Bcl-2、caspase-9和caspase-3表达水平,明显升高促凋亡蛋白Bax表达水平,进一步研究发现,SCL能够显著促进Keap1的表达,并明显抑制Nrf2和HO-1的表达,同时能够明显减少Nrf2的入核表达水平;相应地,流式检测细胞内ROS水平明显升高。综上所述,瑞香狼毒能够显著抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231多药耐药细胞的增殖,引起细胞凋亡,其机制与抑制Keap1/Nrf2信号通路,导致耐药细胞内ROS累积,并增加凋亡相关蛋白的表达有关。

关键词： 华泽兰   Aspergillus puniceus   次级代谢产物   口山酮   三阴性乳腺癌   凋亡  

摘要： 从华泽兰根部分离得到一株内生真菌Aspergillus puniceus.采用正相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及半制备高效液相色谱等方法,从该菌株的发酵液中分离得到8个结构类似的口山酮类化合物,通过现代波谱技术分别鉴定为3′,4′-hydrogenated austocystins A(1)、austocystin M(2)、austocystin F(3)、austocystin D(4)、austocystin B(5)、austocystin K(6)、austocystin A(7)、austocystin H(8).MTT结果显示化合物5对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞具有较好的选择性细胞毒活性(IC_(50)为1.28μmol·L^(-1)).另外,流式细胞术检测化合物5作用于MDA-MB-231细胞后凋亡率的变化,相比于对照组,最高总凋亡率为69.7%.同时,AO/EB双荧光染色也证明化合物5能够诱导MDA-MB-231的细胞凋亡.JC-1线粒体膜电位检测进一步显示化合物5能够通过线粒体途径诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231的细胞凋亡.

关键词： 三阴性乳腺癌   微流控法   紫杉醇   ROR1 siRNA   脂质纳米颗粒  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,TNBC）因其进展快、易转移且预后较差,被称为“乳腺癌之王”。TNBC一线化疗药物紫杉醇（Paclitaxel,PTX）主要通过稳定微管使细胞周期停滞,抑制肿瘤细胞生长。然而,PTX的临床应用受到毒副作用等方面的限制。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptor 1,ROR1）作为膜受体参与诸多信号通路,促进TNBC的增殖和远端转移。基于核糖核酸干扰（Ribonucleic Acid Interference,RNAi）疗法的ROR1小干扰RNA（Small Interfering RNA,si RNA）可有效沉默和干扰ROR1基因的表达,抑制TNBC的生长和迁移。遗憾的是,裸RNA在体内易被降解,递送困难,这使得RNAi疗法在TNBC治疗中受到严重限制。因此,需要寻找合适的递送载体。脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle,LNP）作为一种高效的核酸药物递送载体,可保护ROR1 si RNA递送至靶细胞。同时,微流控法可解决传统LNP制备工艺中粒径分布广及批次间重复性差等问题。基于上述背景,我们利用微流控法制备共载PTX及ROR1 si RNA的脂质纳米颗粒（PR-LNP）,减少PTX的毒副作用,并沉默ROR1基因的表达。本研究主要包括以下三个方面: ***-LNP的制备 通过微流控法制备PR-LNP,以PTX包封率、琼脂糖凝胶中RNA迁移距离为评价指标,采用单因素控制变量法对磷脂的质量、水相介质、氮磷比等因素进行优化。经研究确定最优处方及制备工艺:DOTAP:DOPE:CHOL:DSPE-PEG的质量比为14:56:5:3、水相介质为10 n M p H 4.0柠檬酸盐缓冲液、吐温-80占水相体积的1.5%、药脂比为1:20、氮磷比为8、有机相和水相的流速比为1:3及总流速0.5m L/min。 ***-LNP的表征 对PR-LNP的粒径与电位、形态、包封率和载药量等理化性质及稳定性进行考察,并评价了PR-LNP的体外释放特性。结果显示,PR-LNP粒径为148.50±0.80nm、PDI为0.24±0.02、电位为17.43±0.66 m V,透射电子显微镜下PR-LNP呈形态均一、结构完整的球形。PR-LNP的PTX包封率为96.36±0.34%,PTX载药量为3.35±0.18%;ROR1 si RNA包封率为86.07±1.23%,ROR1 si RNA载药量为0.44±0.03%。PR-LNP在10%血清中24 h内稳定性良好,体外释放结果显示PR-LNP在p H 7.4 PBS中48 h内累积释放率达67%,缓慢释放。 ***-LNP的体外评价研究 采用4T1细胞模型,研究PR-LNP对4T1细胞的摄取、毒性及转移的影响,考察ROR1 si RNA干扰ROR1基因表达情况,评价PR-LNP的体外入胞能力、抑制肿瘤细胞生长和转移能力以及ROR1 si RNA的沉默效果。将荧光标记香豆素6包载于LNP中,摄取实验结果显示4 h内香豆素6荧光强度逐渐增加,4 h后载体LNP促使药物从溶酶体逃逸,使其进入细胞质发挥作用。与流式细胞仪定量测定结果一致。蛋白质印迹实验结果显示80μM ROR1 si RNA在体外可有效阻断ROR1基因的表达。细胞毒性结果显示PR-LNP可显著抑制4T1细胞增殖,其IC为1.39μg/m L,且R-LNP及空白载体安全性良好。细胞划痕、迁移及侵袭实验结果显示沉默ROR1基因表达可显著抑制4T1细胞体外转移,ROR1 si RNA与PTX协同作用,进一步增强抑制转移能力。 ***-LNP的体内评价研究 以4T1荷瘤小鼠为模型,评价PR-LNP在体内的递药特性、代谢情况、抑制肿瘤的增殖和转移能力以及制剂初步生物安全性。采用荧光标记DIR LNP进行组织分布定性、半定量分析及测定PTX在组织中含量,结果显示PR-LNP显著增加24 h内PTX在肿瘤和肺部的药物累积（P<0.05）。在药物动力学中,PR-LNP的PTX半衰期较游离PTX提高1.23倍,血浆清除率降低12.68%,有效延长PTX血液循环时间。药效学评价结果显示PR-LNP组肿瘤抑制率为49.24%,较游离PTX组提高约2.77倍,肿瘤重量较游离PTX组有显著性差异（P<0.001）。对肿瘤TUNEL和CD8T细胞免疫荧光染色切片,结果表明PR-LNP可诱导大量肿瘤细胞凋亡并增加CD8T细胞浸润,促进免疫应答。通过记录肺部结节个数及观察肺部H&E染色切片,结果表明PR-LNP可有效抑制肺转移灶的形成。PR-LNP初步生物安全性考察结果显示荷瘤小鼠给药期间体重

关键词： DNA损伤修复   ATR蛋白   视网膜母细胞瘤蛋白(RB)   三阴性乳腺癌(TNBC)  

摘要： 背景与目的: 三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)是一种恶性程度高、预后最差的乳腺癌亚型,约占乳腺癌病理类型的15～20%;因分子靶标匮乏,TNBC的临床治疗仍以放化疗为主。DNA损伤修复包括DNA损伤的应答(DNA Damage Response,DDR)及修复,其间涉及多种修复蛋白的参与及重要核酸中间体的形成,是应对各类DNA损伤维持基因组稳定的重要系统。由于肿瘤细胞增殖迅速、复制压力大并普遍存在DNA修复缺陷,靶向DNA损伤修复是一种极具潜力的抗肿瘤新策略。 共济失调毛细血管扩张突变基因和Rad3相关激酶(Ataxia Telangiectasia Mutated and Rad-3 Related Kinase,ATR)蛋白是DNA损伤修复中重要的功能蛋白,针对该蛋白开展化学干预研究具有广阔应用前景,但靶向其抗肿瘤的分子机制及精准治疗策略仍不明确,严重制约小分子抑制剂的开发与临床使用。 本研究评价并总结了ATR抑制剂抗TNBC活性与肿瘤分型的关系,发现了视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma,RB)表达高低对ATR抑制剂疗效的影响,阐明了DNA损伤修复新通路ATR-DNAPKcs-RB轴调控TNBC细胞周期的分子机制。据此,本研究提出了靶向ATR-DNAPKcs-RB轴杀伤RB高表达TNBC的抑瘤新策略,也讨论了其在RB低表达TNBC中的应用,为TNBC的精准治疗提供新思路、新策略。 方法与结果: ***抑制剂抗TNBC活性与肿瘤细胞内RB蛋白的表达呈正相关 本研究利用MTT、细胞周期检测、WB等实验验证ATR抑制剂对不同TNBC细胞的毒性以及对其细胞周期进程的影响有明显的选择性。并且,体内实验结果表明ATR抑制剂对不同TNBC细胞的体内抗肿瘤活性也有明显的选择性,并且这种选择性是由于TNBC细胞中RB蛋白表达量的不同,ATR抑制剂对RB阳性细胞增殖抑制作用优于RB阴性TNBC细胞。 2.化学靶向ATR能通过调控hn RNPK蛋白抑制DNAPKcs-RB轴功能,驱动RB阳性细胞由细胞周期G1期向S期转变 本研究利用MTT、WB、RT-q PCR、双荧光素酶报告基因检测、Pull down和质谱分析、RIP等实验探索并验证靶向ATR对不同TNBC毒性和周期进程影响选择性的原因,结果表明,靶向ATR对RB阳性的TNBC细胞毒性强,是由于靶向ATR可以阻断核不均一核糖蛋白K(Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein K,hn RNPK)蛋白在DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit,DNAPKcs)非转录区域的招募而下调后者的表达,抑制RB蛋白的表达并激活转录因子E2F1,加速细胞周期由G1期向S期转变。 3.在RB阳性TNBC细胞中靶向ATR-RB轴与HJ可引起致死性损伤 本研究利用WB、生物膜干涉技术(Biolayer Interferometry,BLI)、凝胶迁移阻滞(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)等实验,发现部分ATR抑制剂有组装HJ的能力,且对HJ有高结合亲和力,这部分ATR抑制剂对RB阳性TNBC细胞的毒性和DNA损伤程度更大,结果表明,由于细胞内HJ的稳定和ATR抑制的相加效应,使ATR抑制剂引起高细胞毒性和致命的DNA损伤。 4.在RB阴性TNBC中靶向ATR治疗效果有限,但联合HRR抑制剂可加剧细胞对HJ的敏感性 RB阴性TNBC细胞中,由于ATR-RB信号轴失活,细胞对ATR抑制和HJ不敏感。通过转录组测序(RNA Sequencing,RNA-seq)、MTT等实验,发现RB阴性TNBC细胞中同源重组修复(Homologous Recombination Repair,HRR)相关基因不受ATR抑制和未修复的HJ的影响。并且探究并验证联合靶向HJ和HRR相关蛋白可以为治疗RB缺陷的TNBC提供一种新的方向。 研究结论: 本研究发现了ATR蛋白在细胞周期调控中的新机制,提出了靶向ATR可以增加肿瘤对化疗敏感的新机制,并提出了精准靶向RB阳性TNBC细胞的治疗新策略,同时,为精准靶向RB阴性TNBC细胞的治疗提供了新思路。

关键词： 地皮菜   三阴性乳腺癌   网络药理学   分子对接   AKT1  

摘要： 目的采用网络药理学方法和分子生物学实验探究地皮菜抗三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)的活性成分与靶点。方法查阅文献并结合实验室前期研究收集地皮菜的活性成分,采用Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测,TTD、Genecards和OMIM数据库获取TNBC靶点。应用STRING在线平台进行蛋白互作,使用Metascape数据库进行KEGG信号通路和GO基因功能富集分析。通过AutoDock软件将地皮菜成分N-乙酰基色胺与靶点AKT1进行分子对接。采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测地皮菜活性成分对乳腺癌细胞凋亡的影响。利用RT-qPCR和Western blotting检测地皮菜活性成分抗TNBC的作用机制。结果网络药理学结果发现N-乙酰基色胺、Scytonemin和Nostocionone等8个有效成分,涉及细胞信号传导和AKT1、STAT3、CCND1等75个关键靶点。KEGG信号通路和GO基因功能富集分析结果涉及癌症相关信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路等。分子对接显示N-乙酰基色胺与AKT1的亲和作用较好。N-乙酰基色胺对乳腺癌细胞没有明显的促凋亡作用,Western blotting结果显示N-乙酰基色胺下调了AKTI的蛋白表达量。RT-qPCR结果显示N-乙酰基色胺可以有效降低乳腺癌细胞AKT1的mRNA表达。结论N-乙酰基色胺可能通过抑制AKT1信号通路抑制TNBC细胞增殖,从而发挥抗TNBC作用。

关键词： 抗雄激素药物   抗雄激素治疗   肿瘤直径   雄激素受体   叉头   三阴性乳腺癌细胞   李惠利   慢病毒转染  

摘要： 本研究通过抗雄激素药物作用于慢病毒转染构建的叉头框家族蛋白A1(FOXA1)高表达管腔样雄激素受体型(LAR)三阴性乳腺癌(TNBC)细胞株,探究抗雄激素治疗在LAR型TNBC中的作用。一、资料与方法1.一般资料:收集2017年12月至2021年12月宁波市医疗中心李惠利医院三阴性乳腺癌患者共104例。按AR表达分为三组:高表达组(AR≥50%);低表达组(10%