关键词:
去甲基雏菊叶龙胆酮
慢性酒精性脂肪肝
自噬
AKT-mTOR
TFEB
摘要:
目的:去甲基雏菊叶龙胆酮(Demethylbellidifolin,DMB)是从龙胆科(Gentianaceae)假龙胆属植物尖叶假龙胆Gentianella acuta(Michx.)Hulten中提取得到的一种呫吨酮类化合物。本实验室在前期的研究中发现尖叶假龙胆的主要活性成分DMB能够减轻急性酒精性肝损伤小鼠的过度炎症反应,但其对慢性酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)的作用及调控机制尚不清楚。因此本课题将着重研究DMB对慢性酒精性脂肪肝(AFLD)的保护作用,并进一步探讨其可能的调控机制,为DMB及尖叶假龙胆的临床应用和相关新药开发提供依据。方法:1、DMB对慢性酒精性脂肪肝小鼠药效作用:75只雄性C57BL/6N小鼠随机分为五组,正常对照组、模型组、美他多辛阳性药组、DMB低剂量组和DMB高剂量组。模型小鼠饲喂含5%v/v酒精的Lieber-De Carli液体饲料,建立小鼠慢性酒精性脂肪肝模型,正常对照组小鼠给予等能量不含酒精的液体饲料配对喂养。实验开始后,各给药组按照DMB 10 mg/kg、20 mg/kg,美他多辛200 mg/kg的剂量灌胃给药7周。每天检测小鼠体重,观察小鼠粪便形态、毛色及活动状态等。实验结束后,收集小鼠血清和肝脏样本。全自动生化分析仪检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、总胆固醇(Total cholesterol,T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、谷氨酰基转移酶(Gamma glutamyltransferase,GGT)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的含量。苏木素-伊红染色法(Hematoxylin eosin staining,H&E)和油红O染色法观察肝脏病理损伤和脂质蓄积情况。使用商品化试剂盒检测小鼠肝脏组织中T-CHO和TG含量。采用免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)检测小鼠肝脏MPO和F4/80原位表达情况。使用商品化试剂盒检测小鼠肝脏中抗氧化相关分子CAT、SOD、GSH和GSH-Px的活性和脂质过氧化产物MDA含量。采用免疫组化技术(Immunohistochemical,IHC)分析小鼠肝脏脂质过氧化产物4-HNE的表达。运用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q PCR)及蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测肝脏中氧化应激及脂质代谢相关基因及蛋白的表达情况。透射电镜观察小鼠肝脏亚细胞结构,明确DMB对酒精性脂肪肝的改善作用。2、DMB对酒精诱导条件下小鼠肝脏自噬的作用:体内实验:WB检测自噬指示蛋白微管关联蛋白-轻链3(Microtubule-associated protein-light chain 3,LC3)和泛素样结合蛋白(Sequestosome-1,p62),自噬体形成相关自噬相关蛋白5(Autophagy Related Protein5,ATG5)和自噬相关蛋白7(Autophagy Related Protein 7,ATG7),溶酶体相关溶酶体相关膜蛋白(Lysosome-associated membrane protein)LAMP1和LAMP2的表达情况,观察DMB对酒精性脂肪肝小鼠肝脏自噬的作用。体外实验:培养小鼠正常肝细胞AML12细胞系,两步胶原酶灌注法提取小鼠原代肝细胞。细胞培养基中加入酒精(200m M)处理24小时构建酒精性脂肪肝体外模型,给予指定的药物处理,并进行相关指标检测。首先油红O染色观察AML12细胞和原代肝细胞中脂滴数量变化。Bodipy染色观察AML12细胞及原代肝细胞中加入自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)后脂滴数量变化,验证DMB对酒精性脂肪肝的改善作用与自噬的关联性。WB检测AML12细胞中自噬指示蛋白LC3、p62,自噬体形成相关ATG5、ATG7和溶酶体膜蛋白LAMP1、LAMP2的表达。对AML12细胞进行stub RFP-sens GFP-LC3腺病毒转染,观察DMB对自噬通量的影响。AML12细胞加入自噬抑制剂CQ和3-甲基腺嘌呤(3 Methyladenine,3MA)处理6小时后,WB检测自噬指示蛋白LC3、p62的表达情况,验证DMB对肝细胞自噬的激活作用。3、DMB调控肝脏脂质自噬的具体