关键词： 蜱   淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒   流行病学   致病性  

摘要： 蜱是一种专性吸血的体外寄生虫,可传播病毒、细菌和原虫等多种病原体,严重影响着人类生命健康及公共卫生安全。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)属沙粒病毒科(Arenaviridae)哺乳动物沙粒病毒属(Mammarenavirus),主要通过啮齿类动物传播。人感染后可是隐形感染,也可是发热、头痛、乏力等近流感症状,以及高热、剧烈头痛、恶心呕吐的脑膜炎型感染症状;妊娠妇女感染可导致流产和胎儿死亡。2018年,在我国东北蜱发现LCMV,遗传进化分析表明该毒株属与人类严重疾病相关的Ⅰ型LCMV,相关研究表明蜱可能是LCMV传播媒介,因此开展蜱源LCMV流行病学及致病性研究对其防控具有重要意义。为了解LCMV在吉林省蜱的流行情况,本实验于2021年4～5月在吉林省敦化市、蛟河市采集牛体表饱血蜱925只和549只,桦甸市采集游离蜱205只,共计1679只。利用建立的Taq Man荧光定量RT-PCR法检测蜱LCMV阳性率,敦化市、蛟河市牛体表饱血蜱LCMV的阳性率为26.7%和9.4%,桦甸市的游离蜱LCMV阳性率为0。获得2株LCMV全基因组序列,与前期分离的吉林省蜱源LCMV核苷酸同源性为96.2%～99.8%,并处于同一分支。为探究蜱源LCMV的致病性,本实验将LCMV JX14株以腹腔接种途径感染BALB/c小鼠。在6 dpi时,小鼠出现被毛蓬乱、半闭眼、呼吸急促、弓背、食欲不振等症状,体重于9 dpi下降至感染前的10%～17%。咽拭子和肛拭子:在4 dpi时均可检出LCMV,雌雄鼠咽拭子的病毒载量在8 dpi达到峰值(10～10 copies/μL),分别于9 dpi和11 dpi时未检出LCMV。雌雄鼠肛拭子的病毒载量分别在4 dpi和5 dpi时达到峰值(10～10 copies/μL),均在9 dpi时未检出LCMV。血液、器官病毒载量结果显示:在3 dpi时,雌雄小鼠均可在血液、器官检出LCMV。血液中LCMV的载量在7 dpi达到峰值(10～10 copies/μL),在30 dpi时未检出。心:雌雄鼠分别在3 dpi、5 dpi时LCMV的载量达到峰值(10～10 copies/μL),至180 dpi时仍能检出LCMV;肝:雌雄小鼠分别在3 dpi、5 dpi时达到峰值(10～10 copies/μL),在15 dpi和90 dpi未检出LCMV;脾:雌雄小鼠均在3 dpi时达到峰值(10～10 copies/μL),分别在30dpi和90 dpi未检出LCMV;肺:雌雄鼠分别在3 dpi、5 dpi时达到峰值(10～10 copies/μL),均在180 dpi时未检出LCMV;肾:雌雄鼠分别在3dpi、5 dpi时达到峰值(10～10 copies/μL),在180 dpi时未检出LCMV;肠:雌雄小鼠分别在7 dpi、5 dpi时达到峰值(10～10 copies/μL),均在90dpi时未检出LCMV;脑:雌雄小鼠在3 dpi、7 dpi时达到峰值(10～10copies/μL),但病毒含量偏低,均在10 dpi时未检出LCMV;睾丸:在5dpi时达到峰值(10 copies/μL),在90 dpi时未检出LCMV。LCMV可引起小鼠的全身感染,除脑外,雌雄小鼠的各器官均能够检出较高的病毒载量。组织病理学观察心、肝、肺、肠出现淋巴细胞浸润等明显的组织病理学变化;脑可见皮层少量神经元皱缩;而肾、睾丸未见明显的炎性改变。荧光原位杂交结果表明感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、睾丸均能检出病毒。血清中的细胞因子IL-5、IL-6、IFN-γ和趋化因子KC(CXCL1)在感染LCMV后有上调趋势。综上,本研究丰富了吉林省蜱源LCMV的流行病学数据,并证实了该毒株对BALB/c小鼠具有致病性,为今后LCMV致病机制研究奠定基础。

关键词： 流行病学调查   慢性肾脏病   血钾   影响因素   中药安全性  

摘要： 目的:调查西苑医院慢性肾脏病非透析患者血钾水平、血钾异常发生率,研究血钾的影响因素,分析中药对血钾的影响,为早期防治慢性肾脏病血钾异常提供参考,避免血钾异常及其相关不良事件发生。方法:采用流行病学横断面调查的研究方法,选取2016年1月至2022年1月于西苑医院住院治疗的慢性肾脏病非透析患者为研究对象。通过结构化查询语言检索西苑医院海泰电子数据库,导出符合纳排标准的2205例患者观察项目资料,并根据血钾水平和拟要研究的影响因素进行分组比较,使用SPSS 26.0软件分析慢性肾脏病非透析患者血钾的影响因素。观察项目:人口学资料包括性别、年龄。病史资料包括慢性肾脏病分期、慢性肾脏病病因、合并病(糖尿病、高血压,冠心病、心功能不全)、并发症(贫血、低蛋白血症、高尿酸血症、高脂血症、代谢性酸中毒)。用药情况包括是否规律使用血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、β受体阻滞剂、排钾利尿剂、保钾利尿剂、阿司匹林、糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯磺酸钙、氯化钾、中药汤剂、中成药。实验室指标包括估算肾小球滤过率、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、总二氧化碳、血红蛋白、血钠、血钾、24小时尿蛋白定量。结果:(1)一般资料:共纳入患者2205例,女性903例(40.95%),低钾血症109例(4.94%),高钾血症420例(19.05%)。其中使用聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯磺酸钙和氯化钾共62例,由于上述药物是明确的高钾血症和低钾血症治疗药物,故后续影响因素分析中予以剔除。纳入影响因素分析患者2143例,女性879例(41.02%),平均年龄(56±16)岁;血钾水平 4.39(4.05,4.83)mmol/L,低钾血症 105 例(4.90%),高钾血症 394(18.39%);慢性肾脏病 1 期 405 例(18.90%)、2 期 376 例(17.55%)、3 期 502例(23.43%)、4期337例(15.73%)、5期523例(24.41%);CKD病因以原发性肾小球疾病1015例(47.36%)为主。(2)不同影响因素分组的血钾水平、血钾异常发生率差异:不同慢性肾脏病分期,不同慢性肾脏病病因,合并与未合并糖尿病、心功能不全,并发与未并发贫血、低蛋白血症、高尿酸血症、代谢性酸中毒,使用与未使用血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、排钾利尿剂、糖皮质激素患者的血钾水平及低钾血症、正常血钾、高钾血症构成比差异均具有统计学意义(均P<0.05)。不同性别、年龄患者仅血钾水平差异具有统计学意义(均P<0.05)。未服用中药/中成药、服用中药汤剂、服用中成药患者的血钾水平及低钾血症、正常血钾、高钾血症构成比差异均无统计学意义(均P>0.05)。(3)不同血钾水平分组的实验室指标差异:高钾血症组与正常血钾组的估算肾小球滤过率、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、总二氧化碳、血红蛋白、血钠、24小时尿蛋白定量差异具有统计学意义(均P<0.05);低钾血症组与正常血钾组的血尿酸、24小时尿蛋白定量差异具有统计学意义(均P<0.05)。(4)血钾水平的独立影响因素分析:以筛选出的影响因素、血钠、24小时尿蛋白定量及中药服用情况为自变量,血钾水平为因变量,进行线性回归分析显示:①慢性肾脏病分期(慢性肾脏病3、4、5期对比慢性肾脏病1期)、慢性肾脏病病因(糖尿病肾病对比原发性肾小球疾病)、心功能不全、贫血、代谢性酸中毒、使用血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂与血钾水平正相关(均P<0.05)。②女性、低蛋白血症、使用排钾利尿剂、使用糖皮质激素与血钾水平负相关(均P<0.05)。③中药服用情况与血钾水平无相关性。(5)血钾异常的独立影响因素分析:继以线性回归自变量为自变量,低钾血症、正常血钾、高钾血症为因变量,进行多因素logistic回归显示:①使用排钾利尿剂、使用糖皮质激素与低钾血症正相关(OR>1,P<0.05),高尿酸血症与低钾血症负相关(OR<1,P<0.05)。②慢性肾脏病分期(慢性肾脏病3、4、5期对比慢性肾脏病1期)、慢性肾脏病病因(糖尿病肾病对比原发性肾小球疾病)、心功能不全、贫血、代谢性酸中毒、使用血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂与高钾血症正相关(OR>1,P<0.05);女性、低蛋白血症、使用排钾利尿剂与高钾血症负相关(OR<1,P<0.05)。③中药服用情况与低钾血症、高钾血症均无相关性。(6)未服用中药/中成药组与服用中药汤剂组倾向性评分匹配分析:以回归分析筛选出的影响因素为协变量,对未服用中药/中成药组及服用中药汤剂组进行倾向性评分匹配后,对比两组的血钾水平及低钾血症、正常血钾、高钾血症构成比,其差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:(1)西苑医院慢性肾脏病非透析患者低钾血症发生

关键词： 肠杆菌科细菌   细菌耐药   超广谱β内酰胺酶   CTX-M  

摘要： 背景:2021年全国细菌耐药监测网(http://***)数据显示:全国不同地区的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素的耐药率依旧处于高水平。第三代头孢菌素耐药最主要的机制就是产生药物灭活酶—超广谱β内酰胺酶,产超广谱β内酰胺酶革兰氏阴性菌在社区和医院感染中已经非常常见,CTX-M基因型是目前最常见的超广谱β内酰胺酶基因型。目的:收集河南大学第一附属医院的产超广谱β内酰胺酶细菌,了解河南大学第一附属医院的CTX-M基因型菌株的耐药情况及CTX-M基因亚型分布情况;选择具有临床意义的多种耐药基因共存的多重耐药菌株进行机制研究;从分子水平简述耐药机制,为临床耐药菌株的传播提供了理论学基础,为延缓细菌耐药提供理论依据。方法:用PCR方法对收集的产超广谱β内酰胺酶细菌进行CTX-M基因扩增,并通过PCR产物测序、拼接、比对获得CTX-M基因亚型及其分布情况;用微量肉汤稀释法检测其对17种抗生素的最低抑菌浓度(MICs);通过纸片扩散法超广谱β内酰胺酶确证实验、质粒接合转移实验、质粒化学转化实验、全基因组测序和注释、抑制质粒接合转移实验、实时荧光定量PCR实验来研究一株同时编码bla 、bla 和bla 的大肠埃希菌(命名为Ec15103)分子耐药机制。结果:分别收集了河南大学第一附属医院2015年和2021年产超广谱β内酰胺酶菌株110株和180株,通过PCR鉴定2015年产超广谱β内酰胺酶菌株中为CTX-M基因型菌株有81株,占73.64%;2021年产超广谱β内酰胺酶菌株有149株为CTX-M基因型ESBLs菌株,占82.78%。在CTX-M基因型菌株中,菌种以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主。CTX-M基因以bla 、bla 、bla 和bla 为主要亚型。与2015年相比,其中bla 一跃成为最2021占比最多的CTX-M亚型,bla 和bla 亚型的占比也有较大增幅。菌株Ec15103包含两个耐药质粒:p Ec15103A,携带耐药基因bla 、aac C2、add A5、sul1、mph(A)、sul2、str AB、tet A(A)的Inc FI型质粒;p Ec15013B,携带bla 的可接合的Inc K2/Z型质粒;bla 位于染色体上。bla 和bla 分别位于由ISEcp1介导的转座子Tn6503a和Tn6502上;p Ec15103B的接合转移能力被齐多夫定(AZT)和亚油酸(LA)显著抑制,且bla 、bla 和bla 是恒定表达,其在m RNA水平上的表达不随抗微生物药物浓度变化而变化。结论:CTX-M基因型阳性率在河南大学第一附属医院临床分离的产超广谱β内酰胺酶病原菌中较高,常见菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,2015年和2021年CTX-M基因型主要以bla 、bla 、bla 和bla 为主要亚型。菌株Ec15103存在多种超广谱β内酰胺酶基因型:bla 、bla 和bla;bla 存在于不可接合转移质粒上,介导着氨苄西林的耐药表型;bla 存在于可接合转移质粒上,介导着头孢噻肟和头孢曲松的耐药表型;bla 存在于染色体上,并独立介导着头孢他啶的耐药表型;齐多夫定和亚油酸可以显著抑制质粒的接合转移,从而抑制耐药基因的水平传播。

关键词： 牛蛙   米尔伊丽莎白菌   按蚊伊丽莎白菌   流行病学调查   生物学特性   TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法   致病性  

摘要： 伊丽莎白菌病是危害我国养殖牛蛙最主要的病害之一,该病典型症状为歪头、白眼、红腿等。目前蛙类伊丽莎白菌病相关研究较少,研究其流行规律、生物学特性和致病性,对于该病的防治具有十分重要的意义。本研究对2020年11月-2022年10月广东省养殖牛蛙伊丽莎白菌病流行情况进行调查,并对分离的伊丽莎白菌株进行生物学特性、致病性研究,主要研究内容和结论如下:1.广东省牛蛙伊丽莎白菌病流行情况分析。本研究于2020年11月-2022年10月对广州、汕头、惠州、清远等地牛蛙场进行病害调查,共采集样本62批,发现病蛙以细菌感染为主（69.8%）,分离病原菌181株,其中伊丽莎白菌（Elizabethkingia sp.）占比最高（22.65%）,其次为气单胞菌（Aeromonas sp.）(16.57%)和不动杆菌（Acinetobacter sp.）(12.71%)、链球菌（Streptococcus sp.）(12.71%)。分离的伊丽莎白菌中除了常见的米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）外,还首次分离到按蚊伊丽莎白菌（Elizabethkingia anophelis）。2.伊丽莎白菌的生物学特性研究。对分离的米尔伊丽莎白菌代表菌株MEYL-1和按蚊伊丽莎白菌代表菌株AWYL-1进行生物学特性研究,两株菌形态、生长特性、pH的耐受能力和胞外产物活性均相似;AWYL-1没有溶血性,而MEYL-1具有β-溶血性;MEYL-1比AWYL-1对盐度的耐受能力强;19种抗生素耐药性检测发现MEYL-1、AWYL-1菌株分别对5种与3种药物敏感,对11种药物和15种药物耐药性较强。3.伊丽莎白菌实时荧光定量PCR检测方法的建立。本研究建立的gyrB TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法标准曲线为（y=-3.3293x+39.609,R=0.9998）具有较好的线性关系,最低可以检测到42 copies/μL的基因拷贝,同时与常见的8种病原无扩增反应。对68份临床病样检测发现,建立的方法比普通PCR检测方法更具准确性。另外,利用该检测方法无创伤采集牛蛙口腔、肛门粘液检测的结果与组织采样检测结果一致,表明无创检测方法可用于牛蛙养殖过程中病原的监测。4.伊丽莎白菌致病性研究。致病力检测发现两株菌均对牛蛙蝌蚪有较强的毒力,感染后出现腹胀腹水、肛门发红等症状;两株菌感染牛蛙死亡率均随着病原的浓度升高而升高,高浓度组死亡率分别达到80%和100%,MEYL-1感染牛蛙出现与自然发病相似的白眼、歪头等症状,AWYL-1感染牛蛙也出现与自然发病相似的全身充血、发红等症状。两种菌感染牛蛙肝、肾、脾、心脏等内脏器官均出现炎症,MEYL-1感染牛蛙脑和眼组织具有严重的病理损伤。组织载量检测发现肝和脑是MEYL-1主要感染部位;肝和肾是AWYL-1菌株主要定植组织。本研究综合症状、病理分析、菌载量变化把米尔伊丽莎白菌病病程分为初期、中期和晚期三个阶段,为牛蛙养殖过程中伊丽莎白菌病的诊断与防控提供了理论依据。

关键词： 戊型肝炎病毒   流行病学   精准检测方法   生猪肝  

摘要： 第一部分戊型肝炎病毒RT-ddPCR检测方法的建立及河北省戊型肝炎病毒基因型研究　　目的：建立HEV的RT-ddPCR检测方法，实现对HEV的定量检测。对河北省不同地区不同来源（农贸市场、超市、屠宰场、养殖场）生猪肝中HEV携带情况调查，并对阳性样品的测序结果进行遗传进化分析。　　方法：参考标准SN/T4235-2015合成HEV的特异性引物探针。并优化引物浓度、探针浓度和退火温度。最后检测其灵敏度、特异性。采用建立的方法与RT-qPCR方法同时对河北省不同地区及来源的生猪肝样品进行检测。使用巢式PCR扩增阳性样品的ORF2基因，扩增产物用于遗传进化分析。　　结果：本实验成功建立了一种特异性检测HEV的RT-ddPCR检测方法，最佳的退火温度为50.7℃，最佳的引物探针浓度分别为900nmol/L、350nmol/L,检出限为1.81copies/μL。本研究共检测了864份生猪肝脏样品，HEV的检出率为1.74%(15/864)。使用巢式PCR方法成功扩增出13株HEV，并从中获得6株新的HEV的序列，所有的毒株均为HEV-4d亚型。　　结论：建立的RT-ddPCR方法特异性、灵敏性良好，对阳性样品的检出率高，可用于HEV的定量检测，为检测和防控HEV的流行和感染提供了有力的技术支持。HEV-4d仍在河北地区广泛流行。　　第二部分戊型肝炎病毒RPA快速检测方法的建立及应用　　目的：建立HEV的RPA系列快速检测方法，包括实时荧光反转录-重组酶聚合酶扩增（qRT-RPA）检测方法和结合侧流层析试纸条的反转录-重组酶扩增检测方法（LFBRT-RPA）。　　方法：基于不同亚型HEVORF2基因的保守区，设计了特异性引物和Exo探针、nfo探针，通过HEVRNA标准样品评估qRT-RPA、LFBRT-RPA方法的特异性、灵敏性。　　结果：qRT-RPA可在42℃恒温条件下20min内完成扩增，LFBRT-RPA可在41℃恒温条件下20min内实现可视化反应。qRT-RPA、LFBRT-RPA的检测限分别为181.54copies/μL、24.11copies/μL。两种检测方法与RT-qPCR相比，在实际样本方检测面均无显著性差异（P=0.25，P=0.50）。　　结论：本研究建立的RPA检测方法操作简单、快速且结果可视化，对资源匮乏地区的HEV快速诊断和防控具有重要意义。　　第三部分基于纳米孔测序技术的戊型肝炎病毒HEV-4d亚型的全基因组测序　　目的：基于纳米孔测序技术，建立HEV-4d亚型的全基因组测序方法，并比较HEV-4d单轮PCR产物与巢式PCR产物用于MinION测序的效果。　　方法：将7组互相重叠且可以覆盖HEV近似全长的巢式PCR引物分为4个“引物池”，使用多重PCR富集病毒，扩增产物使用纳米孔快速测序方法测序。以阳性样品237G为模板，将其外引物的扩增产物、内引物的扩增产物、巢式PCR的产物分别用于MinION测序，测序结果分别与Sanger测序结果进行比较。将HEV-4d阳性样品12G、171G的巢式PCR产物用于MinION测序。　　结果：阳性样品237G的MinION-外引物、MinION-内引物、MinION-巢式的覆盖度分别为97.08%（7058bp）、96.70%（7030bp）、97.04%（7055bp），与Sanger测序结果的一致率分别是99.57%、99.04%、99.84%。单轮PCR产物测序的准确性略低于巢式PCR产物。样品12G与171G的MinION-巢式的覆盖度分别是96.53%（7018bp）、96.73%（7032bp），与Sanger测序的一致率分别为99.39%、99.41%。　　结论：本研究建立的HEV-4d亚型的全基因组测序法操作简单、快速且结果可实时监测，对资源匮乏地区的HEV-4d快速测序和流行病学调查具有重要意义。

关键词： 流行病学调查   个人数据   风险识别   隐私保护  

摘要： 在新冠疫情的流行病学调查中,基于新冠病毒变异周期短、传播速度快等特点,中国政府采取了“大数据+网格化”的流调模式,将数字化流调和传统的人工流调有效地结合起来。数字化流调及人工流调均采集了大量个人数据,此类数据在传播过程中导致个人隐私泄露事件频发。该研究旨在识别新冠疫情流调中个人数据传播的隐私风险,深入探究隐私泄露的路径,并提出针对性的防范策略。该研究首先通过现场调查法对新冠疫情流调的基本环节和方式进行探究,并依据半结构化访谈及内容分析法,对流调中采集和公开的个人数据结构进行分析,研究发现:流调中存在个人数据过度采集和过度公开的事实。此后,基于隐私风险识别原则及风险控制理论,建立基于数据生命周期的隐私风险检查表,据此对34起流调过程中发生的个人数据泄露案例进行隐私风险识别,共识别出17项流调中个人数据传播的隐私风险。为进一步探究个人隐私泄露的路径,在识别出的隐私风险基础上,总结出8个更为具体的条件变量,分别为数据采集程度、工作人员数据安全意识、数据储存管理水平、数据传输安全程度、数据使用规范性、数据公开程度6项内部条件变量以及公众隐私权法律认知、媒体信息挖掘2项外部条件变量,采用定性比较分析法探讨变量组合对个人隐私泄露这一结果的影响。研究发现:(1)单一的条件变量不能导致个人隐私的泄露,但公众隐私权法律认知对于个人隐私泄露会产生重要影响;(2)有4种变量组合对于个人隐私泄露这一结果具有较强的解释力度;(3)来自政府数据管理内部的条件变量叠加来自公众或媒体的外部条件变量会加大个人隐私泄露事件发生的概率,且外部条件变量及其组合不能单独导致个人隐私泄露事件发生。基于前述研究结论,最后有针对性地提出突发公共卫生事件流调中个人隐私的保护策略,具体包括完善个人信息保护的法律及制度体系、建立基于流调数据生命周期的数据管理规范、提升公民个人隐私保护的安全意识以及在平台监管和规范媒体报道等方面强化个人隐私保护的社会治理,以期对以后突发公共卫生事件流调中的个人隐私保护提供参考与借鉴。

关键词： 兔出血症病毒   VP60基因   RT-qPCR   全基因扩增   序列分析  

摘要： 兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD),是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、高度致死性传染病。该病对家兔养殖业造成了巨大的经济损失,也严重威胁了生态平衡。为了了解山东省临沂地区兔病毒性出血症的流行情况,进行了以下研究。参考Gen Bank上登录的RHDV的VP60基因序列,设计了一对通用引物P1-F/P1-R,采用RT-PCR方法对山东省临沂地区采集的157份家兔样品进行检测,并对相应的基因片段进行了测序分析,分别将测序结果正确的阳性样品中的毒株命名为RHDVLY01、RHDV-LY02、RHDV-LY03、RHDV-LY04、RHDV-LY05、RHDV-LY06、RHDV-LY07、RHDV-LY08、RHDV-LY09、RHDV-LY10、RHDV-LY11、RHDVLY12、RHDV-LY13、RHDV-LY14、RHDV-LY15和RHDV-LY16。结果表明,共检出阳性样品16份,阳性率为10.2%(16/157),均为RHDV GI.1a型。为了快速高通量检测RHDV GI.1型,针对RHDV GI.1型的VP60蛋白基因序列,设计了一对特异性引物P2-F/P2-R,并优化RT-qPCR反应条件,建立了灵敏度高、稳定性好的RHDV GI.1型的RT-qPCR检测方法,最低检出浓度为13.1 copies/μL,比常规RT-PCR灵敏度高10倍。为了解RHDV的遗传变异情况,随机选择了RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDVLY11和RHDV-LY16进行了全基因扩增、测序与拼接。结果显示4株RHDV的基因组全长均为7353 bp。使用DNAstar软件对RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDV-LY11和RHDV-LY16的全基因和各基因进行序列分析。结果显示,RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDVLY11和RHDV-LY16共出现核苷酸突变154个,其中错义突变25个。RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDV-LY11和RHDV-LY16之间的全基因核苷酸同源性为99.7%～99.8%,P16基因核苷酸同源性为99.5%～99.8%,P23基因核苷酸同源性为99.4%～99.8%,2C-like基因核苷酸同源性为99.9%～100%,VPg基因核苷酸同源性为99.5%～99.7%,3C-like基因核苷酸同源性为100%,Rd Rp基因核苷酸同源性为99.9%～100%,VP60基因核苷酸同源性为99.8%～99.9%,VP10基因核苷酸同源性99.5%～100%。RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDV-LY11和RHDV-LY16与参考毒株之间的全基因核苷酸同源性为88.6%～97.3%,P16基因核苷酸同源性为87.4%～97.8%,P23基因核苷酸同源性为86.9%～99.1%,2C-like基因核苷酸同源性为87.3%～97.5%,VPg基因核苷酸同源性为86.5%～97%,3C-like基因核苷酸同源性为88.6%～97.1%,Rd Rp基因核苷酸同源性为87.3%～97.2%,VP60基因核苷酸同源性为90.2%～97.9%,VP10基因核苷酸同源性为92.3%～98.4%。RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDV-LY11和RHDV-LY16在P16蛋白上出现了S121L氨基酸突变;另外,RHDV-LY01和RHDVLY11在P16蛋白上还出现了L62S氨基酸突变。RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDVLY11和RHDV-LY16在P23蛋白上出现了V209I氨基酸突变。RHDV-LY01、RHDVLY05、RHDV-LY11和RHDV-LY16在2C-like蛋白上出现了5个氨基酸突变,分别为F30L、H38Y、G189R、C254R和R309G。RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDV-LY11和RHDV-LY16在VPg蛋白上出现了6个氨基酸突变,分别为H131Y、C198R、C228R、C242R、H300Y和W356R;另外,RHDV-LY01和RHDV-LY11在VPg蛋白上还出现了L162R氨基酸突变。RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDV-LY11和RHDVLY16在3C-like蛋白上出现了T40A氨基酸突变。RHDV-LY01、RHDV-LY05、RHDV-LY11和RHDV-LY16在Rd RP蛋白上出现了3个氨基酸突变,分别为V133I、I264T和L282P。在VP60蛋白上,RHDV-LY01出现了I329V氨基酸突变,RHDVLY11出现了I329V与I496K氨基酸突变。RH

关键词： 辽宁省   蜱媒传染病   蜱媒病原体   混合感染   微流体芯片  

摘要： 目的:对辽宁省内新发蜱媒传染病在人群中的感染情况进行筛查,并对筛查出的蜱媒传染病进行流行病学调查,收集蜱媒传染病病例具体临床表现,为蜱媒传染病的诊断治疗提供依据。方法:本研究样本来源为中国医科大学附属第一医院和辽宁省疾病预防控制中心,收集蜱媒传染病疑似患者的血液样本、流行病学信息及临床数据,并依据蜱媒传染病的流行病学特征及临床表现制定严格的纳入标准。提取纳入样本血清中病原体核酸。本研究采用蜱媒病原体微流体芯片检测体系,利用TaqMan的实时扩增检测以及荧光定量PCR技术,同时对多种蜱媒病原体进行筛查,其中包括发热伴血小板减少综合征病毒、斑点热群立克次体、贝纳柯克斯体、噬吞噬细胞无形体、伯氏疏螺旋体、埃立克体、巴贝虫、土拉热弗朗西丝菌。对筛查结果为阳性的病原体进行特异性基因片段的扩增并测序,将所得序列与Gene Bank中已知序列进行比对,建立发育进化树。结果:2018年至2022年,本研究共纳入398份病例,覆盖辽宁省下辖的全部14个地级市,最终检测出蜱媒病原体感染患者255例,其中发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)236例、斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)感染13例、Q热5例以及嗜吞噬细胞无形体感染1例。其中有1例病例为SFTSV与SFGR混合感染。(1)SFTS感染情况:共筛查出阳性病例236例,重症率呈整体上升趋势(Z=2.2045,P<0.05),病死率呈整体下降趋势(Z=-2.2045,P<0.05)。患者平均年龄63.65±12.18岁,患者男女性别比0.94:1,绝大多数患者为农民(77.5%)。所有病例均为散发,有明确蜱虫叮咬史的患者为80例(33.90%),其他患者均有野外活动史或动物接触史。发病高峰期为6-9月份。发病地区主要在大连市、丹东市及营口市。(2)SFGR感染情况:共筛查出阳性病例13例,经测序分析,最终为1例派氏立克次体大西洋雨林株感染,1例猫立克次体感染,11例Candidatus ***暂定株感染。患者的平均年龄为49.54±14.72岁,男女性别比为1.6:1,绝大多数患者为农民。发病时间5-10月份,高峰为6月。地域分布主要集中在丹东市。临床表现主要为发热伴乏力,头痛,皮疹,腹泻。白细胞和血小板计数降低。(3)Q热感染情况:共筛查出阳性病例5例,其中3名患者为70岁以上。发病时间为6-10月份,7月最多。发病地区主要为鞍山市。临床可表现为慢性Q热感染性心内膜炎表现及急性Q热“流感样”表现,可合并肺炎。重症患者并发多器官衰竭而死亡。白细胞计数大多正常,血小板计数减低。(4)嗜吞噬细胞无形体感染情况:筛查出阳性病例1例。中年男性,10月起病,居住于丹东市。临床表现为发热伴周身疼痛,头晕,恶心。白细胞和血小板计数降低,中性粒细胞百分比进行性大幅降低。中性粒细胞受累为其特异性表现。(5)混合感染:本研究筛查出1例SFTSV与Candidatus ***混合感染。临床表现为发热伴乏力,头痛,关节痛,恶心,皮肤可见散在出血点,合并继发性嗜血细胞综合征。结论:1.本研究首次证实Candidatus ***对人的致病性并发现11例感染病例,其中1例为SFTSV与Candidatus ***混合感染。且在辽宁省内首次检出猫立克次体、嗜吞噬细胞无形体和Q热的现症感染病例。因此,在辽宁省及国内其他蜱媒传染病自然疫源地,对于常规实验室检查仍不能明确病原体的感染患者,需考虑除SFTSV外其他蜱媒病原体感染的可能。2.蜱媒传染病临床表现多为非特异性全身反应,常见为发热、乏力、恶心、腹泻、头晕头痛及全身肌肉关节疼痛等。实验室检查可有白细胞、血小板及中性粒细胞计数降低。重症患者可并发多器官衰竭而死亡。3.2018年至2022年,辽宁省发热伴血小板减少综合征病死率呈整体下降趋势,但重症率呈整体上升趋势。

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征   病毒的分离   流行病学研究   遗传变异分析   重组分析  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种高度接触性传染病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的,能够造成机体免疫抑制,并引起多系统的功能障碍。由于PRRSV病毒感染后会引起患病猪只耳朵发绀呈蓝紫色的典型临床症状,故PRRS又被称为“猪蓝耳病”。此外,该病毒还会引起生殖系统障碍,妊娠期母猪主要表现为屡配不孕、流产和产死胎、木乃伊等;公猪主要表现为精液质量下降,影响生育能力;仔猪表现为发热、呼吸衰竭、高死亡率等。不仅如此,不同变异毒株之间产生的抗体交叉保护力较弱,目前广泛用于PRRS防控的灭活苗和改良减毒疫苗不能对猪只提供全面的、足够的免疫保护力,使疾病的防控和我国养猪业产生巨大冲击。因此,对我国PRRSV进行监测和监控,并分析其流行情况和遗传进化以及变异情况是如今防控该病的关键环节。在本研究的2021-2022年间,了解中国部分地区PRRSV的大致流行情况,并对阳性样品和分离毒株进行多位点的序列分析、遗传进化分析以及重组分析,探究病毒在我国的大致流行情况以及遗传进化和变异规律,为我国对PRRS的防控提供基础数据和理论支持。1.我国部分地区在2021-2022年间临床疑似发病样品的鉴定和序列分析在本研究中,共处理我国26个省、市、自治区不同猪场在2021-2022年间送检的690份临床样品(肺脏组织、脾脏组织、淋巴结、母猪生产的死胎和胎衣等),对这些临床病料进行2种基因(Nsp2和ORF5)的RT-PCR鉴定及扩增产物的序列分析,鉴定结果表明,Nsp2和ORF5基因均为阳性的样品共有139份,平均下来阳性率为20.14%。对样品进行测序,并与参考株进行序列分析和遗传进化分析,结果显示主要流行毒株为HP-PRRSV(约23%)和NADC30-Like毒株(约50%)。2.病毒的分离鉴定以及基于Nsp2、ORF5的序列分析及推导氨基酸分析将检测为阳性的病料接种于PAM细胞和Marc-145细胞,共分离得到6株PRRSV毒株,进行Nsp2和ORF5等基因及推导氨基酸分析,结果显示,分离的6株均为美洲型(基因Ⅱ型);基于ORF5基因构建遗传进化树,1株和JXA1在同一分支,2株和NADC34在同一分支,3株和NADC30在同一分支;在Nsp2推导氨基酸的区域有标志性不连续缺失131个氨基酸(111+1+19);且在其他位点也有突变和缺失。3.分离株的全基因组测序和重组分析对分离毒株进行全基因组扩增并测序,再进行变异重组分析。结果显示,在Nsp2推导的氨基酸序列对比中,除了特征性缺失外,GZ3-2022连续缺失3个氨基酸,He N6-2022连续缺失5个氨基酸;GP5蛋白分析显示,在抗原肽区域和中和表位区域,均有毒株发生缺失或突变;与毒力相关的13位氨基酸和151位氨基酸也有突变产生。重组分析结果显示,PRRSV的潜在重组频繁发生且重组情况较为复杂。不仅在Nsp2和ORF5区域发生潜在重组情况,在ORF1β、ORF2-4等区域也存在潜在重组现象。同时,还存在多种毒株重组的情况,如ZJ1-2022毒株,潜在重组情况较为复杂,同时与NADC30、NADC34和HP-PRRSV均产生潜在重组。总的来说,我国猪繁殖与呼吸综合征的流行率达到20%以上,不同地区的流行情况较为复杂,且随着季节的不同流行率也随之变化。我国主要的流行毒株为NADC30-Like和HP-PRRSV,占比约为50%和23%,其他美洲型亚基因型也存在并流行,同时也存在多种毒株重组的情况,应持续对PRRS进行防控,防止大面积的暴发和流行。