关键词： 牛   副结核分枝杆菌   PCR   荧光定量PCR   流行病学调查  

摘要： 牛副结核病是由副结核分枝杆菌(MAP)引起的一种反刍动物慢性消化系统疾病,该病给我国的养牛业造成了巨大的经济损失。为了建立快速、简便、特异、灵敏的副结核分枝杆菌检测方法,本试验根据Gen Bank上发布的副结核分枝杆菌IS900和F57基因的序列,在其高度保守区域内分别设计特异性引物及探针,通过对引物、探针浓度及退火温度的优化,分别建立了副结核分枝杆菌IS900和F57基因的普通PCR检测方法、副结核分枝杆菌双基因荧光定量PCR检测方法,并应用本试验建立的定量PCR方法对全国部分地区牛场进行副结核分枝杆菌流行病学调查。结果显示,建立的两种副结核分枝杆菌检测方法均可从多种牛腹泻疾病的病原中只检测到副结核分枝杆菌IS900、F57核酸,表明本试验所建方法具有良好的特异性;MAP F57扩增出的目的条带约为222 bp,可检测到的最低拷贝数为1×10copies/μL;MAP IS900扩增出的目的条带约为328 bp,可检测到的最低拷贝数为1×10copies/μL;而双重荧光定量PCR检测方法中,F57最低核酸检测量可达5 copies/μL,IS900最低核酸检测量可达2.5 copies/μL,均有较高的敏感性。两种检测方法均重复扩增出了与目的条带大小一致的目的片段,双基因荧光定量PCR检测方法的批内变异系数及批间变异系数均小于1%,表明本试验所建方法具有良好的重复性。应用本试验所建的双基因荧光定量PCR检测方法对全国部分地区牛场363份核酸样品进行检测,结果显示,阳性样品共57份;其中F57阳性为52份,IS900阳性为14份,双基因阳性样品为9份。发现内蒙古、宁夏、新疆、山西、河南、黑龙江等地牛场阳性率分别为13.90%、5.55%、26.82%、21.42%、10.34%、68.18%。本研究为快速检测副结核分枝杆菌提供了不同的检测方法,操作简便、特异性强、灵敏度高、稳定性好,为副结核分枝杆菌的流行病学调查及快速诊断提供技术支撑。

关键词： 河南省   犬   五毛滴虫   毕氏肠微孢子虫   人兽共患   肠道菌群  

摘要： 五毛滴虫和毕氏肠微孢子虫是两种在世界范围内广泛流行的肠道寄生虫,具有人兽共患性。可以感染包括家畜、野生动物和人类的多种宿主,也可以通过水源、粪便、口腔等多种途经传播。这两种寄生虫可引起免疫正常的动物发生自限性腹泻;然而,如果免疫能力较差或有免疫缺陷的动物感染这两种寄生虫,则可能引起持续水样腹泻,最终导致死亡。这两种病寄生虫主要通过粪便-口腔传播,同时,动物食用被污染的食物,饮用被污染的水也可引起感染。近几年宠物行业在中国蓬勃发展,宠物保有量持续升高。众所周知,犬作为重要的伴侣动物与人有着密切的关系,这难以避免的增加了人类感染动物携带的寄生虫的风险,给宠物主人的健康带来威胁。然而五毛滴虫和毕氏肠微孢子虫在宠物犬身上流行和潜在的动物传染病却少有报道。为了解宠物犬五毛滴虫、毕氏肠微孢子虫在河南宠物犬中的虫种、基因型、流行情况和人兽共患风险,本研究采集了来自河南省6个地区的1393份宠物犬粪便样品,进行基于SSU r RNA基因位点的巢式PCR扩增,结果发现26份五毛滴虫阳性样品,总感染率为1.87%(26/1393)。不同采样点的五毛滴虫感染率为0.84%-2.50%,感染率在统计学上具有极显著差异(P<0.01),其中郑州时宠物犬的五毛滴虫感染率最高,为2.50%。通过对阳性扩增产物进行测序分析,鉴定出2种五毛滴虫基因型:CC1(17/26)和CC2(9/26),此两种基因型均为人兽共患型。从1393份宠物犬粪便样品中根据地区、性别、月龄、品种随机选出569份样品进行基于ITS基因位点的巢式PCR扩增毕氏肠微孢子虫,得到198份阳性样品,总感染率为34.80%(198/569)。测序分析结果显示,共鉴定出6种ITS基因型:TypeⅣ(24/198)、HenanⅤ(13/198)、Ebp C(19/198)、CD 5(34/198)、CD 9(25/198)、Pt EbⅨ(83/198),其中4种为常见的基因型TypeⅣ、HenanⅤ、Ebp C和Pt EbⅨ,Pt EbⅨ为优势基因型,TypeⅣ、HenanⅤ和Ebp C为人兽共患型。基于16S rRNA测序结果分析健康犬感染五毛滴虫后对肠道菌群的影响,研究发现,感染犬五毛滴虫的犬只肠道Alpha多样性中物种丰富度相关参数无显著性变化,物种多样性显著升高,在门水平上,阳性组优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)及梭杆菌门(Fusobacteriota),在属水平上,普氏菌属(Prevotella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、负性振动杆菌属(Negativibacillus)、比伯斯坦杆菌属(Bibersteinia)、泰泽氏菌属(Tyzzerella)、Uminococcus torques group、Sellimonas和芽孢杆菌属(Bacillus)为阳性组优势菌属。PCo A分析表明,阳性组与对照组宠物犬粪便中的肠道微生物群落发生了明显分离,形成了差异显著的肠道菌群聚类,这表明健康犬感染五毛滴虫肠道菌群结构发生改变。感染犬五毛滴虫的犬只肠道中有害细菌(梭杆菌属、芽孢杆菌属、Tyzzerella、比伯斯坦杆菌属)相对丰度显著上升。上述结果表明,犬只感染犬五毛滴虫后后,其肠道菌群的多样性及肠道菌群结构会发生改变,同时有害细菌相对丰度上升。综上,本研究中犬感染的两种五毛滴虫和三种毕氏肠微孢子虫具有人兽共患风险,提示这两种肠道原虫在宠物与人之间有相互传播的可能性,给未来对此两种寄生虫进行有效的临床防控提供了科学依据,具有一定的公共卫生意义;五毛滴虫犬肠道菌群的多样性及肠道菌群结构会发生改变,同时有害细菌相对丰度上升,为研究五毛滴虫感染对宠物犬肠道菌群的影响提供了重要科学依据。

关键词： 肠道病毒   手足口病   流行病学   基因重组   基因特征  

摘要： 目的了解2016-2020年安徽省手足口病(HFMD)相关肠道病毒病原谱构成及肠道病毒分子流行病学状况,了解安徽省其他肠道病毒毒株基因特征,探讨不同型别肠道病毒适宜生长的细胞系,探讨其他肠道病毒在手足口病流行过程中的重组情况及致病情况,以期为安徽省HFMD防控与策略制定提供基础资料。方法1.样本与毒株来源:2016年1月-2020年12月安徽省各市疾病预防控制中心(CDC)上送到安徽省CDC微生物检验室的HFMD患儿咽拭子标本,选取代表性其他肠道病毒核酸阳性样本480份。全基因组测序毒株为HFMD病原监测与检测中细胞组织分离培养获得,保存于-70℃以下冰箱。2.样本鉴定:提取样本RNA,进行VP1区基因及全基因组扩增,对其PCR产物进行琼脂糖电泳、基因测序等分析。3.细胞毒性实验:将成功分离且鉴定的CV-A6,CV-A10和CV-A4毒株分别感染RD细胞,Vero细胞及Hep-2细胞,通过观察不同细胞对肠道病毒致病情况及计算TCID50,分析肠道病毒对不同细胞的致病力。4.生物信息学分析:Bio Edit 7.2.5软件对序列进行同源性分析;MEGA 6.0软件对本研究序列与代表序列进行裁剪比对,构建VP1区及全基因组进化树;Arc GIS 10.2软件绘制发病率地图;RDP4软件检测重组信号;Simolot 3.5软件对重组事件进行验证;Graph Pad Prism 9软件绘制病毒感染性滴度图。结果1.流行病学分析显示,2016-2020年安徽省累计报告HFMD病例471 995例,其中重症共949例,死亡共11例,年均发病率为151.4/10万。发病率仍处于较高水平,但重症病例与死亡病例数有所减少,5个年度均以其他肠道病毒流行为主,五岁以下散居儿童为主要患病人群,占所有病例的76.48%,男女性别比为1.50∶1。发病具有季节性特征,常存在2个高峰期。5个年度各地市均有病例报告,皖北地区为疾病高发地区,皖中地区次之,皖南地区发病率最低。累计报告病例数位于前三位的地区分别为阜阳市(82695例)、合肥市(81763例)、亳州市(45835例)。2.基因进化分析显示,2016-2020年均以其他肠道病毒流行为主。分型鉴定的245份样本,共含有5个基因型,其中CV-A6 215例,占87.76%(215/245),CV-A1016例,占6.53%(16/245),CV-A4 12例,占4.90%(12/245),CV-A5 1例,占0.41%(1/245),CV-A2 1例,占0.41%(1/245)。其中CV-A6占比最大,为引起安徽省手足口病的主要病原。VP1区进化分析显示,安徽省CV-A6流行型别为D3a,CV-A10流行型别为C2,CV-A4流行型别为C2,均为中国大陆地区优势流行型别,并存在不同传播链,均与原型株相聚较远,与国内其他地区毒株亲缘关系较近,表明安徽省毒株同国内毒株共循环共进化,且五年间流行型别无变化。3.细胞病变实验显示,三种型别肠道病毒不同细胞系中发生CPE的程度不同,CV-A4和CV-A10在RD细胞中病毒病变出现的更彻底,而CV-A6在三种细胞系中均未发生明显CPE。4.重组分析提示安徽省CV-A6与CV-A10均可能来源于重组株,安徽省CV-A6毒株在P2及P3区有重组情况发生,CV-A5与EV-A92可能为序列重组亲本;CVA-10在P3区有小片段重组情况,CV-A5可能为序列重组供体或重组近亲。重组对肠道病毒的毒力和传播力有一定的影响。结论1.安徽省手足口病发病率仍处于较高水平,但重症病例与死亡病例数有所减少,5个年度均以其他肠道病毒流行为主,五岁以下散居儿童为主要患病人群,男女性别比中男性患者比例占优势;疾病呈季节性分布,夏秋季高发,存在一大一小两个高峰期;发病人数较多的为皖北地区。2.其他肠道病毒已经成为引起安徽省手足口病的重要病原,其中以CV-A6占主导。监测的三种其他肠道病毒基因型别均为中国大陆流行型别,并且仍处于进化中。3.对于不同型别肠道病毒复制适宜的细胞系仍需扩大样本量和细胞种类后进一步研究,以助于提高各型别病毒分离率,RD细胞仍是目前肠道病毒分离的适宜细胞系。4.安徽省流行的CV-A6与CV-A10毒株可能来源于重组株,在P2区与P3区有重组断点提示,CV-A5及EV-A92可能为序列重组供体之一,重组对肠道病毒的毒力与传播力有一定的影响。

关键词： 犬   椎间盘突出   影像学诊断   治疗   预后  

摘要： 近年来,犬患椎间盘突出越来越常见,轻症会导致疼痛、轻瘫,重症则致瘫痪,影响患犬生活质量,且患犬发病年龄集中于中青年犬,提高患犬的生活质量及主人满意度显得尤为重要。随着高阶影像的普及,目前椎间盘犬的诊断通常采用CT或MRI进行。本文通过对收集病例的回顾性分析,从神经学、影像学、细胞学诊断与临床症状、治疗及预后结合分析,对比X射线、CT和MRI影像学检查结果,分析影像,找出最适合的诊断方法和分级方法;根据以往病例中总结经验,能为之后患犬提供更好的治疗管理方案,提高患犬生活质量及主人满意度。本试验对武汉某动物医院2020.8-2023.2间椎间盘突出症患犬病例进行收集,收集标准为患有椎间盘疾病且不患有其他导致类似症状疾病、经CT或MRI检查确诊为椎间盘突出症的病例,收集内容包括基本信息、病史、临床症状、神经学检查、血液学检查、影像学检查(包括CT、MRI及X射线)、细胞学检查,同时密切关注动物的治疗效果与预后,共收集172例椎间盘突出病例。将椎间盘突出的影像学指标与临床症状交叉分析,指标包括椎间盘突出的水平面位置(中央型、旁中央型、外侧型、极外侧型)、横断面位置(a域、b域、c域、d域)、矢状面位置(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ层面),CT图像中突出物形状(山丘状、弧状、孤岛状、絮状),MRI图像中神经根情况(是否受压)、脊髓信号(是否信号异常)、汉森分型、Pfirrmann分级,临床症状严重程度用神经学分级(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)进行衡量。对动物的治疗进行回顾性分析,将不同治疗方法的动物进行分类统计,对神经学分级与治疗方法进行交叉分析,治疗方法有口服药物、皮下注射药物、针灸、激光、手术治疗,或其中几项联合治疗。对动物预后与影像学指标、主人饲养护理情况进行交叉分析,影像学指标包括水平面突出类型、横断面突出类型、神经根情况,主人护理包括是否限制运动、控制体重,预后分为预后良好与预后不良,由于椎间盘疾病保守治疗不能痊愈,不影响正常生活、与患病前生活质量差异不大为预后良好,影响正常生活、生活质量明显降低为预后不良。通过统计分析,从品种上看泰迪犬是发病最高的品种,占32.56%;从年龄看,3-6岁为发病高峰期;从性别看雄性犬发病最多,占51.74%;从BCS体况评分来看,4分(5分制)占发病犬最多,为41.28%;从行为上看,上下沙发多、上下楼梯多、站立次数多会诱发疾病产生;从突出位置看,单处突出较多,胸腰椎发病多,突出在T12-L2高发;从突出类型看,中央型、a域、Ⅰ层面最多,汉森Ⅰ型多于汉森Ⅱ型。X射线诊断敏感性为40%,CT诊断敏感性为82.71%,MRI诊断敏感性为100.00%。MRI目前为犬椎间盘突出症最佳诊断方法,可以直接观察脊髓与神经根的状态;CT诊断敏感性不如MRI,但较MRI可以更清晰观察到钙化椎间盘的形态与位置,扫描速度较快,适用于椎间盘手术时手术通路定位;X射线敏感性最低,但不需要麻醉,在无法进行CT与MRI检查时可以作为辅助诊断手段。在影像学指标中,与症状严重程度相关性较高的指标有椎间盘突出水平面位置、神经根与脊髓状态,发生外侧型与极外侧型、神经根受压及MRI T2WI脊髓信号升高导致临床症状严重的可能性较大;与预后相关性较高的指标有椎间盘突出水平面位置、椎间盘突出横断面位置及神经根状态,发生外侧型与极外侧型、神经根受压导致预后不良的可能性较大,横断面发生b域、c域、d域类型突出导致保守治疗后复发的可能性较大。对于上述预后不良可能性较大的病例建议手术治疗,保守治疗效果甚微,其余情况可保守治疗。为了减少该病的发生和复发,建议减肥,适度运动,减少上下沙发、上下楼梯、站立等行为。

关键词： 猪腹泻病   猪流行性腹泻病毒   猪德尔塔冠状病毒   流行病学   逆转录-环介导等温扩增检测  

摘要： 猪腹泻病是养猪生产中经常遇到的重大难题之一，环境应激、饲养管理不当以及病原体感染均可导致猪腹泻的发生。引起猪腹泻的病原较多，其中猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）对养猪业危害较为严重，尤其是新生仔猪感染后出现较高的死亡率。及时诊断是防控PEDV和PDCoV最有效的方法，因此建立一种快速、准确、简便的检测方法是防控PEDV和PDCoV的重要课题。本研究的主要研究内容和取得的研究结果如下：　　1.研究建立了PEDV和PDCoV的逆转录-聚合酶链式反应（Reverse-transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）检测方法，对2021年1月-2023年2月新乡市腹泻猪进行流行病学调查。　　（1）根据PEDV的M基因和PDCoV的N基因的保守序列，分别设计了一组PCR引物，建立了PEDV和PDCoV的RT-PCR检测方法。　　（2）RT-PCR性能（特异性、敏感性、重复性和复核试验）测定结果表明，PEDVRT-PCR方法与PDCoV和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）无交叉反应，灵敏度达到103拷贝/μL，重复性较好，与国标PEDVRT-PCR检测方法符合率为94.3%;PDCoVRT-PCR方法与PEDV和TGEV无交叉反应，灵敏度达到102拷贝/μL，重复性较好，与地方标准PDCoVRT-PCR检测方法符合率为100%。　　（3）对新乡市2021年1月-2023年2月采集的1530份猪腹泻样品进行检测，在1530份猪腹泻样品中，共检出PEDV阳性432份，阳性率为28.2%，PDCoV阳性189份，阳性率为12.4%，两种病毒共感染样品49份，共感染率为3.2%;PEDV和PDCoV冬季检出率最高，表明冬季为PEDV和PDCoV多发季节。　　2.研究建立了PEDV和PDCoV的逆转录-环介导等温扩增（Reverse-transcriptionloop-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP）诊断方法。　　（1）根据PEDV和PDCoV的ORF1a/b基因保守序列共设计27组特异性LAMP引物，其中PEDV特异性引物11组，PDCoV特异性引物16组，通过LAMP反应筛选出最佳引物组，并对反应时间、反应温度、Mg2+浓度、内引物浓度、外引物浓度、dNTPs浓度、酶浓度和Buffer浓度进行了优化。结果表明，PEDV的2号引物组为最佳引物，基于该引物的最佳RT-LAMP反应体系为：时间50min，温度60℃，Mg2+浓度80mmol/L，内引物浓度32μmol/L，外引物浓度5μmol/L，dNTPs浓度10mmol/L;酶浓度10000U/mL，Buffer浓度0.8×（Tris-Hcl40mmol/L、（NH4）2SO480mmol/L、KCl400mmol/L、TritonX-1000.8%、MgSO416mmol/L）;PDCoV的11号引物组为最佳引物，基于该引物的最佳RT-LAMP反应体系为：时间50min，温度60℃，Mg2+浓度100mmol/L，内引物浓度48μmol/L，外引物浓度5μmol/L，dNTPs浓度10mmol/L，酶浓度4000U/mL，Buffer浓度1.4×（Tris-Hcl70mmol/L、（NH4）2SO4140mmol/L、KCl700mmol/L、TritonX-1001.4%、MgSO428mmol/L）。基于上述优化的RT-LAMP反应条件，加入甲酚红指示剂，构建了PEDV和PDCoV的可视化RT-LAMP检测方法。　　（2）RT-LAMP性能（特异性、敏感性和重复性）测定结果表明，PEDV可视化RT-LAMP检测方法能特异性检出PEDV，与PDCoV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）和TGEV均无交叉反应，最低检测限为10拷贝/μL;PDCoV可视化RT-LAMP检测方法能特异性检出PDCoV，与PEDV、PRRSV和TGEV均无交叉反应;最低检测限为10拷贝/μL。　　（3）对132份临床样品检测结果表明，PEDV可视化RT-LAMP和RT-PCR对PEDV的阳性检出率分别为33.3%（44/132）和31.1%（41/132），二者的符合率为97.7%（129/132）;PDCoV可视化RT-LAMP和RT-PCR对PDCoV的阳性检出率为11.4%（15/132）和10.6%（14/132），二者的符合率为9

关键词： 前列腺炎   流行病学   问卷调查   危险因素  

摘要： 目的:探索慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征可能的相关危险因素,为预防和治疗慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征提供参考依据。方法:通过对2017年8月至2019年7月期间在陕西省人民医院泌尿外科门诊就诊确诊为慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的患者238例,以及同期健康体检合格的244例健康男性患者进行相同的问卷调查并记录。问卷包括受访者一般情况、生活习惯、既往疾病及用药史、性生活习惯。剔除数据不合格的问卷后198例慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征患者设为病例组,204例设为对照组。利用SPSS22.0软件对各变量进行单因素分析,计数变量采用χ检验或秩和检验、等级变量采用秩和检验,通过多因素logistic回归筛选慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的主要危险因素。通过对2020年7月至2022年7月期间在陕西省人民医院内分泌科门诊就诊确诊为慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征且合并2型糖尿病患者82例,以及同期就诊的2型糖尿病的男性患者82例进行问卷调查并记录。问卷包括受访者一般情况、生活习惯、既往疾病及用药史、性生活习惯。利用SPSS22.0软件以年龄匹配成功匹配69对,对各变量进行单因素分析及多因素logistic回归的分析筛选慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的主要危险因素。结果:1.在单因素分析中:病例组和对照组在不同学历、不同职业构成比率、喜食水果、吸烟、饮酒、紧身内裤的使用、熬夜与否、久坐程度、运动程度和憋尿的程度、糖尿病史、二甲双胍长期使用、性生活的频率的差异上具有统计学意义（P<0.05）。2.通过多因素非条件logistic回归分析示:对慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征具有保护性因素（OR<1）的有:文化程度、经常锻炼、经常服用二甲双胍。危险因素（OR>1）的有:工人、企业职员、司机、长期饮酒、总是久坐、一周性生活频率≤1次或≥4次。3、在患2型糖尿病的人群中,长期使用二甲双胍是糖尿病病人慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的唯一独立影响因素,且为保护性因素,OR=0.217,P=0.002结论:1.文化程度、职业构成比、喜食水果、长期吸烟、长期饮酒、喜穿紧身内裤、经常久坐、经常锻炼、经常憋尿、长期服用二甲双胍、性生活频率是慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征患病的相关因素。2.职业、长期饮酒、总是久坐、过低或过高的性生活频率是慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征患病危险因素,文化程度、经常锻炼及长期服用二甲双胍是慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的保护因素。3.长期服用二甲双胍可能是慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的保护因素。

关键词： 牛诺如病毒   分子流行病学   全基因组序列  

摘要： 牛诺如病毒（Bovine norovirus,BNoV）属于杯状病毒科,诺如病毒属的RNA病毒,是国内新发的犊牛腹泻的病原之一,已在世界各国养殖业广泛流行,在粪便、消化道中长期存在并快速传播。BNoV的高变异性、多宿主性以及存在潜在人兽共患风险值得我们对其深入研究,其多存在于奶牛、肉牛中,且多呈隐性感染或混合感染,尽管BNoV已被证实在中国的存在,但其在云南地区的流行及分子特征仍不清楚,应当引起养牛业的重视。因此,建立针对BNoV的高效检测方法及分子检测研究,为科学防控BNoV提供理论依据。本研究在对BNoV保守区分析的基础上,建立了BNoV普通RT-PCR及Real-time RT-PCR方法,对云南省13个地区15个牛场所收集的655份牛粪便样品进行感染情况检测,并对部份BNoV阳性样品的全基因进行基因测序及遗传进化分析,研究获得以下结果:（1）建立BNoV的普通RT-PCR检测方法,最低检测量为9.67×10～3copies/μL;检测出阳性份数25份,阳性率3.82%。同时建立BNoV的Real-time RT-PCR检测方法,最低检测量为9.67×10 copies/μL;检测出阳性份数32份,阳性率4.89%。两种检测方法均具有良好特异性、敏感性、稳定性。（2）不同年龄BNoV检测结果:1周龄、1周龄～1月龄、1月龄～6月龄和1岁以上粪便样品中BNoV检出率分别为15.00%（3/20）、15.93%（18/113）、1.87%（6/321）、2.49%（5/201）。腹泻样品和非腹泻样品BNoV检出率分别为8.99%（25/278）、1.86%（7/377）。奶牛、肉牛、牦牛粪便样品BNoV检出率分别为5.92%（32/540）、0%（0/104）、0%（0/11）。（3）对BNoV阳性样品进行Rd Rp基因片段扩增测序,获得6株Rd Rp序列,分别命名为BNoV-YN01～06-2022,与33株参考株进行遗传进化分析,表明:云南6株同在一个进化分支上,均属于BNoV GIII.2型;其株间核苷酸同源性94.0%～98.4%。（4）设计13对特异性引物对阳性样品进行全基因扩增测序,分别命名为BNoV-YN01-2022、BNoV-YN02-2022,长度分别为7281bp、7293 bp,包括部分5'UTR和3'UTR及三个完整的开放阅读框。具有典型BNoV基因组结构,在ORFl和ORF2重叠区交界处均存在一段高度保守的核苷酸序列ATGAAGATGACTGA（5075 bp-5088 bp）。与33株参考序列遗传进化分析显示:两株毒株间核苷酸同源性为97.6%;与中国新疆毒株同处一个分支上,发育进化也与其聚拢,同源性最高,同属GIII.2型。RDP4软件重组预测分析,2株全基因组仅有BNoV-YN02-2022株在ORF3（VP2）区域存在基因重组情况,亲本主要为中国新疆毒株和挪威毒株。其与GIII.2原始毒株Bo/Newbury2/1976/UK衣壳蛋白预测及氨基酸位点突变分析显示:BNoV-YN01-2022衣壳蛋白与原始毒株衣壳蛋白结构相似,BNoV-YN02-2022衣壳蛋白表面可能性、蛋白亲水性和抗原指数均有所改变,这种改变与氨基酸位点突变相对应,主要集中在P高变区域,以上结果揭示BNoV或许通过这种重组和突变适应进化,为后续免疫检测方法应用打下基础,有助于深入研究蛋白结构和功能的关系。

关键词： 非人灵长类动物   芽囊原虫   隐孢子虫   毕氏肠微孢子虫   十二指肠贾第虫   流行率   风险因素   基因型  

摘要： 芽囊原虫(Blastocystis sp.)、隐孢子虫(Cryptosporidum spp.)、毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)是世界范围内常见的四种人兽共患肠道原虫,这四种肠道原虫主要以粪-口途径传播。当人或动物误食被这四种肠道原虫的包囊/卵囊/孢子污染过的水源、蔬菜、水果和其它食物时容易感染肠道原虫疾病。当免疫力较弱的宿主被上述四种原虫感染后,会影响宿主的胃肠道功能,常表现为持续性的头晕、恶心、呕吐、腹痛等临床表现,如不及时治疗,严重时会造成寄主腹泻性死亡。因此对这四种肠道原虫的分子溯源,跨物种传播及适应性以及基因遗传变异对于人类公共卫生安全是十分必要的。已经有越来越多的文献对这四种肠道原虫病进行了详细的报道。当前,已经有多个研究聚焦于对养殖场圈养猴和动物园观赏猴肠道原虫的流行病学调查,但是关于云南地区养殖场圈养猴感染这四种肠道原虫的相关报道还十分有限,本研究以非人灵长类动物(non-human primates,NHPs)为实验对象,调查这四种肠道原虫的流行情况,旨在对云南省玉溪市元江县和昆明两个地区养殖场饲养猴的四种肠道原虫的感染情况和基因遗传变异进行探究。2021年7月-8月,共从云南省玉溪市元江县和昆明市两个主要饲养猴地区随机采集圈养猴的粪便样品共计392份。利用分子生物学检测技术,基于小亚基核糖体RNA(SSU r RNA)基因的PCR扩增及测序对芽囊原虫进行检测;基于大亚基核糖体RNA(LSU r RNA)基因的巢氏PCR扩增及测序进行隐孢子虫的检测;基于核糖体RNA内转录间隔区(ITS)的巢氏PCR扩增及测序进行毕氏肠微孢子虫的检测;基于β-giardin(bg)和glutamate dehydrogenase(gdh)基因位点的巢氏PCR扩增及测序进行贾第虫的检测。结果显示,在392份圈养猴样品中,感染芽囊原虫的阳性率为85.46%(335/392)、隐孢子虫的阳率为10.71%(42/392)、毕氏肠微孢子虫的阳性率为1.02%(4/392)、十二指肠贾第虫的阳性率为0%(0/392)。其中芽囊原虫的总感染率明显高于其它三种肠道原虫,是所调查区域养殖场圈养猴感染肠道原虫的优势虫种。由于本实验中未检出十二指肠贾第虫,所以不对其进行风险因素统计分析和基因型遗传进化分析。统计学分析显示,芽囊原虫在非人灵长类动物中与感染率相关的风险因素为年龄(P<0.01)和地区(P<0.01)。通过对335份阳性芽囊原虫PCR产物的测序分析及遗传进化分析,共鉴定出五种芽囊原虫基因型,分别为ST1(n=113)、ST2(n=24)、ST3(n=177)、ST5(n=19)、ST10(n=2),其中ST3基因型占比为45.15%(177/392),已超40%以上,推测ST3是元江和昆明两地区芽囊原虫的优势基因亚型。对隐孢子虫进行检测,发现隐孢子虫在非人灵长类动物中与感染率相关的风险因素为年龄,且差异显著(P<0.01)。通过测序分析及遗传进化分析,发现42份阳性隐孢子虫样品基因型均为***。同时基于gp60基因对42份***阳性样品进行分型鉴定,根据亚型“TCA”序列的重复性鉴定,共有六种***基因亚型被鉴定,分别是Ii A17(n=5)、Ib A9(n=4)、In A23(n=1)、In A24(n=2)、In A25(n=3)和In A26(n=18)。对毕氏肠微孢子虫检测,发现性别、年龄、地区及品种均不是其感染率相关的风险因素。通过测序分析及遗传进化分析,共鉴定到三种毕氏肠微孢子虫基因型,分别为D(n=1)、CM1(n=2)和CM13(n=1)。然而未在所调查地区的非人灵长类动物中发现贾第虫感染。本研究对元江县和昆明市两个地区所采集的392份养殖场圈养猴的样品进行四种肠道原虫的流行率、相关风险因素及基因型/虫种的调研。实验数据有助于评估这四种肠道原虫在集中饲养的食蟹猴与猕猴中的遗传多样性,为云南地区养殖场圈养猴的四种肠道原虫病的研究提供了基础数据,也为当地猴场的饲养人员预防和控制这四种肠道原虫的传播及云南地区公共卫生安全提供必要的基础信息。

摘要： 《药物流行病学杂志》是由湖北省药品监督管理局主管，湖北省药品监督检验研究院、中国药学会、武汉大学中南医院联合主办的药学与药物流行病学领域的学术期刊。本刊集中报道与药学、药物流行病学相关的最新研究成果及方法，为中国科技核心期刊、中国科技论文统计源期刊，先后被《国际药学文摘》、《美国化学文摘（CA）》、WHO西太平洋地区医学索引等国际知名检索机构收录。