关键词:
鸡肉
沙门菌
耐药性
mcr基因
摘要:
食源性疾病是危害人类健康的重大公共卫生问题,沙门菌是最常见的食源性致病菌之一。沙门菌是一种常见的革兰氏阴性兼性厌氧菌,属于肠杆菌科,可以通过禽畜肉类、水果、蔬菜等途径感染人类,引起胃肠炎、伤寒、菌血症等疾病。我国每年由沙门菌引起的食物中毒事件位居微生物所致食物中毒的首位,而受污染的生禽畜肉是人感染沙门菌最重要的途径。因此,有必要对生禽畜肉中的沙门菌污染水平进行持续监测,控制该病原体从食品向人类的传播。多粘菌素(Polymyxin)为多粘芽胞杆菌合成的一种多肽类抗菌药物,早先由于其肾毒性和神经毒性,限制了其在临床上的使用,但是近年来由于耐碳青霉烯类肠杆菌的出现,多粘菌素又被重新用于临床,并被视为抵御革兰氏阴性多重耐药菌感染的最后一道防线。先前普遍认为多粘菌素的耐药机制是染色体突变,2015年我国学者首次在全球报道质粒介导的可移动黏菌素耐药(mobile colistin resistance,MCR)机制及相关基因mcr-1,并证明该基因可在不同肠杆菌科细菌之间进行水平传播。多粘菌素类药物在临床上的再次启用,以及新的耐药机制的发现,导致其耐药率显著增加,给人类公共卫生安全带来巨大的威胁。近年来,对黏菌素耐药基因mcr家族的报道越来越多,目前已发现10种mcr家族成员及80种相关突变体。大肠埃希氏菌是mcr相关研究中最常见的细菌种类,而携带mcr基因的沙门菌则相对报道较少,但近年来检出率有逐年递增趋势。因此,需加强我国对mcr基因的长期持续监测,了解其流行特点,为临床治疗和政策制定提供理论依据。目的1.了解2020年12月至2021年11月济南零售鸡肉中沙门菌的污染状况及流行病学特征,为食品中沙门菌的防控措施提供科学依据。2.基于全基因组测序分析食源性沙门菌血清型及分子流行病学特征。3.对分离株进行质粒介导黏菌素耐药基因mcr的筛选,探讨食源性沙门菌对多粘菌素类药物的耐药特征及致病性。方法1.样品采集与菌株分离自2020年12月至2021年11月,每月在济南市采集鸡肉样品20~30份。依据《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验》(GB 4789.4—2016)对样品中的沙门菌进行检验,从预增菌到生化试验的整个流程使用标准菌株肠炎沙门菌(EQAS 2012S4)和鼠伤寒沙门菌(CMCC 50333)作为阳性对照。2.沙门菌种属鉴定使用生化试验和PCR法对分离培养出的菌株进行复核、鉴定,对任一试验结果为阴性的菌株使用VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析仪进行生化鉴定,获得沙门菌分离株。3.肠炎沙门菌血清型筛选使用特异性鉴定基因(ENT)对禽类食品中沙门菌优势血清型肠炎沙门菌血清型进行PCR鉴定。4.沙门菌药物敏感性试验依据样品信息与肠炎沙门菌血清型筛选结果,选择50株沙门菌代表株,使用VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析仪测定沙门菌分离株对四环素类、青霉素类等16种抗菌药物的敏感性。5.全基因组测序及分析提取沙门菌分离株的核酸并对其进行浓度和质量的测定,将达到要求的DNA送往天津诺禾有限公司进行全基因组测序,获得其基因组数据,并对基因组数据进行沙门菌血清型分析、多位点序列分型(Multi locus sequence typing,MLST)及耐药基因分析。***基因筛检使用PCR法对多粘菌素耐药基因mcr-1~mcr-9分别进行筛选,对于mcr基因阳性的菌株进行三遍复核确定。***基因阳性菌株药物敏感试验补充试验使用微量肉汤法对mcr基因阳性的菌株进行药物敏感性试验补充试验,抗菌药物包括替卡西林、哌拉西林等12类,共42种。***基因阳性菌株毒力表型研究以强毒力印第安纳沙门菌MS1-1、金黄色葡萄球菌SA为对照菌株,以磷酸盐缓冲液为阴性对照,同时设置空白对照,建立大蜡螟感染模型,分别间隔24 h、48 h、72 h、96 h记录大蜡螟幼虫的死亡情况,绘制生长曲线,对mcr基因阳性菌株进行毒力表型研究。9.数据分析使用SPSS V25.0软件包对沙门菌检出率进行χ2检验,检验水准为α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.零售鸡肉中沙门菌检出情况2020年12月至2021年11月采集的260份鸡肉样品中,检出阳性样品58份,阳性率为22.31%(58/260);共检出沙门菌100株,其中56株菌株为肠炎沙门菌,占菌株总数的56.00%。从样品采集时间来看,秋季(9-11月)样品中沙门菌检出率最高(53.33%,32/60),春季(3-5月)检出率最低(10.00%,6/60)。不同季节采集样品中沙门菌检出率差异具有统计学意义(χ2=44.110,P<0.01)。从样品采集地点类型来看,超市、网络电商平台、农贸市场和零售店四种类型采样地点所采集的样品中分别有24份、2份、21份和14份