关键词： 人星状病毒   污水   环境监测   二代测序   系统发生  

摘要： 人星状病毒(HAstV)是无包膜的单正链RNA病毒,是导致全球儿童急性胃肠炎的常见病毒之一,也有研究认为其与免疫力低下患者的中枢神经系统疾病如脑膜炎、脑炎有关。HAstV包括经典型HAstV-1～-8型和最近发现的新型HAstV-MLB和HAstV-VA型。大量研究表明,环境污水监测是了解监测地区人群中胃肠炎病毒流行情况和多样性的有效方法,是不依赖临床病例监测的重要监测手段。然而,目前还缺乏对环境污水中经典型和新型HAstV的综合性研究。近年来,扩增子二代测序(Next generation sequencing,NGS)技术在胃肠道病毒的环境污水监测中开始得到应用,其针对污水浓缩液PCR扩增阳性产物进行NGS测序,大大丰富了污水中的病毒谱。本研究在2018～2021年期间每月于山东省济南市光大污水处理厂采集污水样本,与以往的集中于HAstV ORF1b或ORF2的部分区域不同,本研究的扩增区域为ORF2全长编码区,因此将获得更为全面的序列信息,在此基础上开展序列分析,探索污水中HAstV型别分布和时间动态变化特征,以期为胃肠炎疾病的预防控制和预警机制的建立提供科学依据。研究目的1.基于ORF2全长编码区扩增NGS技术,探索山东省济南市2018～2021年环境污水中经典型HAstV和新型HAstV的型别分布。2.通过对环境污水中HAstV流行信息的收集与分析,补充临床病例监测资料,从而获取全人群流行资料,进而探究其长期循环动态变化。3.通过对山东省济南市HAstV与国内外其他地区型别进行系统发生学分析,提高对HAstV传播的认识。研究方法1.环境污水的采集与浓缩:2018～2021年共采集济南市光大污水处理厂进口处污水48份,使用阴离子膜吸附洗脱加超声波震荡法对其进行富集浓缩。2.病毒核酸提取:按照MagMAX病原体RNA/DNA提取试剂盒说明书操作,手动操作提取病毒核酸。3.病毒核酸的扩增与测序:RT-PCR扩增HAstV ORF2全长编码区基因片段,阳性产物经NGS测序,对产生的干净数据使用CLC Genomics Workbench 12.0软件de novo组装后,进行基因定型。4.相似性分析与系统发育学分析:采用BioEdit7.***.9.0软件进行相似性分析;使用MEGA 11.0软件,构建系统发生树。主要结果***的检出情况研究期间共采集生活污水48份,40份为HAstV阳性,阳性率83.3%。共获得94个扩增子,经NGS分析共检出16种HAstV,包括经典型HAstV(-1～-6、-8),HAstV-MLB(MLB1～MLB3)和 HAstV-VA(VA1～VA6)。其中 3 种经典型 HAstV(HAstV-1、HAstV-3和HAstV-4)在HAstV阳性的污水样本中均被检测到。本研究在22.5%(9/20)的污水样本中检测出与VA分支同源的新型别VA6,共获得VA6ORF2全长序列9条,其与最接近的毒株VA5的核苷酸相似性为82.3%～83.3%。2.基于ORF2全长编码区的相似性比较和系统发育分析根据本研究检出的HAstV型别相似性分析显示,同一型别的山东株相似性最高,系统发育分析显示,HAstV-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-5、VA1山东株被分为2个或2个以上的遗传谱系,存在多个共循环的传播链。此外,还发现了一支大部分由山东株序列组成的新型别谱系VA6。所有型别的山东株在系统进化树上均聚集在同一型别内。主要结论1.2018～2021年山东省济南市环境污水中检出了多种型别的HAstV,包括新型别VA6和MLB2、MLB3等较为罕见的型别,型别谱显著丰富。2.基于NGS的环境监测极大提高了对HAstV传播的认识,应建立专门的HAstV环境监测系统,以结合临床病例监测资料,充分了解和掌握其在人群中实际循环传播情况。***-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-5、VA1山东株在监测人群中存在不同进化分支的共同流行情况。本研究获取的山东株表现出明显的空间及时间聚集性。

关键词： 猫   慢性龈口炎   流行病学调查   口腔菌群   药物敏感性试验  

摘要： 猫慢性龈口炎(Feline chronic gingivostomatitis,FCGS)是一种口腔溃疡性和/或增生性病变,典型病变位置是腭舌褶,由于其发病机制未知、病程慢长,存在治疗难度大、复发率高的问题。患猫通常表现为口腔疼痛、食欲减退、口臭、流涎、精神沉郁和体重减轻等临床症状,严重影响患猫生活质量。口腔菌群是第二大微生物群,细菌大多数以共生的方式存在于口腔中并维持动态平衡,当平衡被打破时,可能会引发疾病。本文通过收集西安三所综合性宠物医院2021年9月至2022年9月就诊的3109例患猫的病历资料,并对其中患有FCGS的61例病例进行问卷调查、常规口腔检查和实验室检查;统计分析FCGS的发病率及发病特征,并对实验室检查结果进行统计整理,为该病的防控和诊断提供理论支持。选取16例半口/全口拔牙手术治疗的FCGS患猫采集术前及术后45 d的口腔菌群样本,同时采集6只健康成年猫口腔菌群样本;通过16S r DNA测序进行微生物种属鉴定,探索可能存在的特征性病原菌。对FCGS患猫口腔菌群进行药物敏感性试验;并分离鉴定可疑致病菌,将得到的典型菌株使用琼脂稀释法进行最低抑菌浓度的测定,为抗菌药物的选择提供建议,主要研究结果如下:1.通过流行病学调查发现,西安地区FCGS患猫的发病率与年龄、性别和品种无明显相关性。在FCGS患猫中未进行免疫接种、流浪史和多猫饲养环境的占比较高,且均患有不同程度的牙结石。2.实验室检查结果发现,FCGS患猫普遍表现为中性粒细胞数目升高;血清淀粉样蛋白A升高明显;患猫杯状病毒抗原阳性率高;可能还存在牙槽骨水平丢失或牙吸收等问题;组织切片可见大量的炎性细胞浸润。***患猫与健康猫口腔菌群相比,菌群多样性增加且厌氧菌丰度明显升高,卟啉单胞菌属、密螺旋体属和梭杆菌属富集于患猫口腔,可能为FCGS潜在致病菌;患猫经过拔牙治疗后,口腔菌群组成趋于正常。4.选择庆大霉素、阿莫西林、头孢氨苄、头孢曲松、阿奇霉素、恩诺沙星、多西环素和甲硝唑进行体外药物敏感性试验,结果显示FCGS患猫口腔菌群对恩诺沙星敏感性较高,对甲硝唑敏感性低。***患猫口腔中分离得到一株卟啉单胞菌与古卟啉单胞菌同源性高,该临床分离菌株对恩诺沙星敏感性高,对头孢氨苄和甲硝唑耐药。综上所述,西安地区FCGS的发病与免疫接种、流浪史和多猫饲养环境等因素密切相关;患猫中性粒细胞数目、血清淀粉样蛋白A升高,杯状病毒抗原阳性率高。患猫口腔内潜在病原菌丰度升高,经拔牙治疗后其口腔菌群组成趋于正常。临床上可考虑选择恩诺沙星作为经验性辅助治疗药物。

关键词： 禽流感病毒   分子遗传学特征   受体结合特性   HA基因   NA基因   免疫抗体水平   流行病学调查   遗传演化分析  

摘要： 禽流感(Avian influenza,AI)是禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种侵害呼吸系统的传染性疾病。该病呈世界范围流行和传播,给我国养禽业带来巨大损失,能跨越种属感染人等哺乳动物,对人类公共卫生安全造成了极大的威胁。为了解宁夏地区禽流感病毒的流行情况、免疫抗体水平与分子遗传学特征,本试验通过随机抽样的方法,对宁夏全区2022年13个规模禽场、7个活禽交易市场采集的1450份样品以及103个散养户、22个规模禽场采集的880份血清分别进行病原学与血清学检测。将RT-PCR方法扩增的HA、NA基因阳性产物进行序列测定分析,遗传进化分析结果与关键氨基酸位点分析结果如下:1.病原学检测结果表明,宁夏禽流感总阳性率为8.41%,H9亚型禽流感病毒阳性率为6.48%,共检测出1个鸭子样品为H1亚型禽流感、5个鸡样品为H3亚型禽流感、1个鸡样品为H6亚型禽流感、94个鸡样品为H9亚型禽流感。2.血清学检测结果表明,H5N6(Re-13)、H5N8(Re-14)与H7N9(Re-4)亚型禽流感规模禽场以及散养户免疫抗体水平总体个体合格率、场群合格率均高于98%,符合高于农业部70%要求,具有群体保护力。3.H1N2亚型禽流感病毒HA基因与国内广西、安徽等地及国外蒙古等地高度一致,NA基因与国内广西、安徽等地及国外越南、日本等地高度一致;HA基因226Q、228G位点表明具有典型禽源受体结合特性。H3N8亚型禽流感病毒HA、NA基因与国内河南、湖南、香港等地及国外越南、蒙古和美国各大州分离株高度一致;HA基因226Q、228G位点表明具有典型禽源受体结合特性,与我国河南首次报道人源H3N8病毒高度一致。H6亚型禽流感病毒HA基因与国内河南、湖南等地高度一致,与国外日本、美国各大州分离株高度一致;HA基因240Q、242G位点表明具有典型禽源受体结合特性。H9N2亚型禽流感病毒HA基因与国内厦门、江西分离株等地高度一致,属于H9.***.2.5分支,为2007年后我国流行的主要分支;NA基因与国内厦门、广东分离株等地高度一致,与H5N2的NA基因有较高的一致性。HA基因Q234L位点突变表明具有人源受体结合特性,与人源H9N2病毒序列高度一致。

关键词： 原发性膜性肾病   流行病学调查   中医证型   临床特征   实验室指标  

摘要： 目的:本研究旨在通过大样本横断面调查研究方法,探寻原发性膜性肾病(Primary Membranous Nephropathy,PMN)患者的中医证型分布特点,分析中医证型与患者一般情况、临床症状、实验室指标的关系,为PMN的辨证论治提供思路,为PMN的中医证候规范化研究提供新的客观依据。方法:拟定《原发性膜性肾病患者调研表》,采取流行病学横断面方法进行调查,纳入191名符合标准的PMN患者,收集患者的临床症状,舌脉,对PMN患者进行辨证分型,采用SPSS26.0软件进行数据处理,分析其中医证型分布规律,并进一步研究PMN证型与患者一般资料、临床症状、舌脉、相关实验室指标(血浆白蛋白、24小时尿蛋白定量、肾功能、血脂、凝血机制)及抗磷脂酶A2受体(Phospholipase A2 Receptor,PLA2R)抗体之间关系。结果:1.基本资料分析:(1)191例PMN患者中男性123人,女性68人,男女之比为1.8:1;年龄分布以61-70岁之间为多,比例为31.4%。(2)病程在1年之内的PMN患者人数最多,占62.8%;(3)从事体力劳动为主的患者较多,为102人,占53.4%;从事脑力劳动为主的患者为73人,占38.2%;(4)发病诱因:无明显诱因及劳累占比较大,分别占41.4%及29.8%;(5)合并疾病占比:高血压病>糖尿病>无合并疾病>其他疾病>冠心病>肺系疾病。2.临床症状及舌脉分布:(1)临床症状:出现频率超过10%的症状分别为神疲乏力、小便泡沫、双下肢水肿、大便不成形、眠差、颜面浮肿、腰脊酸痛、口中黏腻、口苦、肢体困重、易自汗、胃脘胀满、胸闷憋气、食少纳呆、头晕或头痛、口干、耳鸣、心慌、畏寒肢冷、大便干结。(2)舌象:出现频率超过10%的舌质分别是暗红、暗淡及红;频率大于10%的舌苔分别是白腻苔、薄白苔、白苔及黄腻苔。(3)脉象:出现频率超过10%的脉象分别是沉细脉、沉脉、弦脉及弦滑脉。3.中医证型分布:(1)本证:脾肾气虚证>脾肾阳虚证>肺肾气虚证>肝肾阴虚证>气阴两虚证。(2)标证:湿浊证>湿热证>血瘀证>风湿证>湿浊血瘀证。(3)兼夹证:脾肾气虚证多与湿浊证、湿热证兼夹,肺肾气虚证多与风湿证、湿浊证兼夹,肝肾阴虚证多与湿热证兼夹,脾肾阳虚证与湿浊证兼夹为多。无本证患者以湿浊证居多。4.中医证型与基本资料:(1)PMN各证型间性别、年龄分布以及病程长短均未见明显差异(P均>0.05)。(2)PMN各证型间BMI无显著差异(P>0.05)。(3)慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)1期患者的中医证型分布无明显差异,CKD2期患者的主证中脾肾阳虚证及气阴两虚证占比较高(P均<0.05)。5.中医证型与实验室指标:(1)PMN本证及标证中血浆白蛋白水平均差异明显(P均<0.05),本证中脾肾阳虚证患者的血浆白蛋白水平较低;标证中湿浊血瘀证及血瘀证的血浆白蛋白水平较低。(2)本证及标证中24小时尿蛋白定量水平均差异明显(P均<0.05)。本证中气阴两虚证及脾肾阳虚证24小时尿蛋白定量水平较高,标证中湿浊血瘀证24小时尿蛋白定量水平较高。(3)本证中脾肾阳虚证、气阴两虚证患者的血肌酐、尿素及估算肾小球滤过率(Estimate glomerular filtration rate,e GFR)水平较高(P均<0.05),标证中血瘀证患者的血肌酐水平更高(P<0.05),尿素及e GFR水平各标证间不存在显著差异。(4)本证中脾肾阳虚证的总胆固醇水平较高(P<0.05),脾肾阳虚证及气阴两虚证的甘油三酯水平较高(P均<0.05)。标证中湿浊证的总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平较高(P均<0.05),湿浊血瘀证的甘油三酯及低密度脂蛋白水平较高(P均<0.05)。(5)本证及标证中D-二聚体及纤维蛋白原水平均差异明显(P均<0.05)。本证中脾肾阳虚证及气阴两虚证D-二聚体及纤维蛋白原水平较高,标证中血瘀证及湿浊血瘀证D-二聚体及纤维蛋白原水平较高。(6)抗PLA2R抗体阳虚率为67.5%,在抗PLA2R抗体阳性的病例中,脾肾阳虚证及气阴两虚证抗PLA2R抗体水平较高,标证间抗PLA2R抗体水平未见明显差异(P均<0.05)。结论:***患者中男性占比高于女性,老年人是易感人群,体力劳动为主的患者占比较高,多数患者无明显诱因发病,最常见的发病诱因为劳累。2.归纳PMN患者临床症状及舌脉表现,临床患者多表现脾肾脏腑亏虚之象,湿、热、瘀为最常见的病理因素。***本证属脾肾气虚证者居多,标证属湿浊证者居多。脾肾气虚证常与湿浊证、湿热证兼夹,肺肾气虚证常与风湿证、湿浊证兼夹,肝肾阴虚证常与湿热证兼夹,脾肾阳虚证与湿浊证兼夹为多。无本证患者以湿浊证居多。4.脾肾阳虚证及气阴两虚证的PMN患者

关键词： 斑点热群立克次体   伯氏疏螺旋体   蜱   宿主动物   贵州  

摘要： 目的:通过现场流行病学调查结合实验室检测鉴定,对贵州山区蜱及携带病原体情况展开研究,了解贵州蜱传斑点热群立克次体和伯氏疏螺旋体的流行病学特征,初步掌握媒介蜱和宿主动物蜱传病原体的感染状况及其分布,为当地蜱传疾病防治提供科学数据。方法:1.根据贵州的野外生境、蜱的生活习性等因素,利用体表采集法捕获贵州省不同地区家畜动物体表寄生蜱,用静脉采血法采集不同地区家畜动物抗凝血液样本。2.将捕获的蜱肉眼初步观察大致分类,在正置显微镜下进行拍照,记录蜱的背面观,腹面观等特征。根据蜱的不同发育阶段进行初步形态学鉴定,使用试剂盒提取蜱DNA。采用PCR技术扩增蜱的线粒体16S r RNA基因片段,用分子生物学技术鉴定蜱种。3.对采集的蜱和动物全血样本提取DNA后,用SFGR柠檬酸合酶(glt A)、外膜蛋白酶A(omp A)基因及***间隔基因5S～23S r RNA为靶标基因进行PCR扩增,将双向测序结果用美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)Gen Bank中的BLAST进行序列比对,使用MEGA 7.0软件构建系统发育树并进行遗传进化分析。4.采用SPSS 26.0对实验结果进行统计学分析,率的比较采用χ检验,若P<0.05,则差异有统计学意义。结果:1.根据实地放牧区域或动物栖息的区域等具体情况确定采样点,从贵阳市乌当区共采获宠物犬寄生蜱133只;安顺市牛寄生蜱209只;施秉县牛寄生蜱617只;罗甸县羊寄生蜱67只;铜仁市羊寄生蜱26只;岑巩县牛寄生蜱31只,共采获1083只蜱。发现贵州省家畜寄生蜱种为血红扇头蜱(***)、微小扇头蜱(***)、长角血蜱(***)、镰形扇头蜱(***)、北岗血蜱(***)。2.本研究采获的1083只蜱经检测发现立克次体阳性数为703份,总阳性率为64.91%,通过序列分析发现劳氏立克次体(Rickettsia raoultii)和敬信立克次体(Ca ndidatus ***)的基因片段,同时经检测发现蜱还携带了伯氏疏螺旋体,阳性数为178份,总阳性率为16.43%,发现的基因分型为***。本研究发现家畜寄生蜱中存在斑点热群立克次体和伯氏疏螺旋体的复合感染,感染率为14.86%(161/1083)。3.本研究采集贵阳市乌当区猫血153份;犬血142份;罗甸县羊血18份;岑巩县羊血14份;铜仁市羊血56份;安龙县羊血12份,共采集396份血液。对采集的396份动物全血样本进行检测后发现立克次体阳性数为1份,总阳性率为0.25%,通过序列分析发现猫氏立克次体(Rickettsia felis)的基因片段,同时经检测发现了动物携带了伯氏疏螺旋体,阳性数为62份,总阳性率为15.65%,发现的基因分型为***。4.经统计学分析,贵州六个地区媒介蜱携带的SFGR的阳性率差异有统计学意义(χ2=614.041,P<0.05),贵州省六个地区媒介蜱携带的***的阳性率差异有统计学意义(χ2=49.665,P<0.05),贵州省媒介蜱携带SFGR和***的阳性率差异有统计学意义(χ=281.738,P<0.05),贵州省3种宿主动物感染*** gdorferi的阳性率差异有统计学意义(χ2=8.109,P<0.05)。结论:1.本研究采用分子流行病学调查的方法,证实中国西部地区贵州省媒介蜱存在劳氏立克次体和敬信立克次体感染,同时发现媒介蜱感染伯氏疏螺旋体,均为公认的对人类具有致病性的病原体。2.发现贵州省贵阳市宠物猫携带***,研究同时检出了动物猫、犬、羊***的基因片段。家畜动物作为SFGR和***的重要宿主动物,与人类密切接触,提示存在人类感染蜱传病原体的风险。3.贵州省家畜寄生蜱同时复合感染两种严重威胁人兽健康的病原体:斑点热群立克次体和伯氏疏螺旋体。提示在蜱媒疾病流行地区接受诊断和治疗的蜱咬患者时,应考虑可能存在蜱传病原体复合感染的情况,以便制定正确的治疗方案。

关键词： 云南   牛冠状病毒   流行病学   调查  

摘要： 肉牛产业已然成为云南省农业农村经济的重要支柱产业,但云南规模化饲养水平不高、兽医技术人才缺乏、引种不规范、跨区调运、边境走私等多种综合因素的影响,牛群疫病复杂。牛冠状病毒(BCoV)是引起犊牛腹泻、冬季痢疾和牛呼吸道疾病综合征的重要病原之一,给养牛业造成了严重的经济损失。为了解云南省部分地区牛冠状病毒病的流行情况,从云南7个州市7个县采集了5个牛品种的血清样品285份,使用ELISA进行血清学检测;从云南11个州市15个县采集了16个牛品种的粪便样品616份,建立RT-qPCR方法进行病原学检测。主要结果如下:1、通过血清流行病学调查,BCoV抗体总阳性率为21.75%(62/285)。(1)从不同地区看:保山市隆阳区阳性率为93.33%(28/30),昆明市寻甸县阳性率为53.85%(14/26),楚雄州双柏县阳性率为42.55%(20/47),曲靖市罗平县、昭通市鲁甸县、红河州蒙自市、临沧市云县的血清样品中未检出BCoV血清抗体。(2)从不同品种看:短角牛阳性率为53.85%(14/26)、滇中牛阳性率为42.55%(20/47)、海福特牛阳性率为20.29%(28/138),在安格斯牛、西门塔尔牛的血清样品中,未检测出BCoV血清抗体。(3)从牛只健康状况(腹泻或健康)看:腹泻牛BCoV总体阳性检出率为25.56%(46/180);健康牛BCoV总体阳性检出率为15.24%(16/105)。2、建立BCoV RT-qPCR检测方法,检出限为0.248pg(原始模板为248ng/ul),此方法灵敏度高、有较高的特异性;将酶切成功的质粒测序,与NCBI数据库已发布的牛冠状病毒S基因序列同源性均在97.9%以上,表明目的基因序列为牛冠状病毒。3、粪便样品中BCoV核酸总阳性率为28.73%(177/616)。(1)从不同地区看:昭通市鲁甸县、大关县、临沧市云县、耿马县、保山市隆阳区、德宏州芒市、迪庆州香格里拉、曲靖市罗平县、昆明市寻甸县、楚雄州双柏县、红河州蒙自市牛群中BCoV核酸阳性率分别为65.00%(39/60)、50.00%(2/4)、44.44%(32/72)、37.50%(75/200)、28.85%(15/52)、14.29%(4/28)、13.04%(3/23)、10.53%(2/19)、9.09%(2/22)、6.25%(1/16)、4.76%(2/42);文山州广南县、普洱市江城、红河州个旧县、红河县粪便样品中均未检测出BCoV核酸。(2)从不同品种分析检测结果:发现10个云南本地品种,BCoV阳性检出率为5.30%(8/151);6个引进品种,BCoV阳性检出率为36.34%(169/465)。安格斯牛42.00%(21/50)、海福特牛39.68%(123/310)、荷斯坦奶牛39.13%(18/46)、德宏水牛16.67%(1/6)、独龙牛15.38%(2/13)、西门塔尔牛13.79%(4/29)、迪庆牛13.04%(3/23)、娟姗牛12.50%(1/8)、云南高峰牛11.11%(1/9)、短角牛9.09%(2/22)、滇中牛6.25%(1/16)、在红河黄牛、滇东南水牛、江城黄牛、文山牛、摩拉水牛中,未检测出BCoV抗原核酸。(3)正常牛粪中BCoV总阳性检出率为20.50%(65/317);腹泻牛粪中BCoV总阳性检出率为37.46%(112/299)。云南部分地区牛群中存在BCoV感染,地方品种抗性比外来品种好,使用RT-qPCR方法能对粪便中BCoV快速检测。应加强对该病的监测及预警,为云南省BCoV的防控和研究提供数据及技术支撑。

关键词： 非结核分枝杆菌   菌种鉴定   流行病学   临床特征   耐药性  

摘要： 目的:由于NTM肺病的致病过程和临床表现与肺结核较为近似,容易误诊为肺结核甚至耐药肺结核,导致治疗效果不佳。近年来,我国NTM感染呈现上升趋势,已成为重要的公共卫生问题。本研究旨在分析近年在安徽省胸科医院就诊患者中非结核分枝杆菌(NTM)肺病患者的NTM菌种分布、临床特点及耐药情况,为NTM肺病防治策略的制定提供参考。方法:收集2021年1月到2022年3月在安徽省胸科医院就诊患者的呼吸道标本,采用酸性罗氏培养、结核分枝杆菌早期分泌蛋白(MPB64)抗原和对硝基苯甲酸(PNB)选择性培养基进行初步鉴定,同时采用16S RNA编码基因及热休克蛋白65(hsp65)编码基因方法进行菌种鉴别,根据菌种结果及《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020年版)》鉴定为NTM的患者,收集其临床资料,回顾性分析NTM肺病菌种分布、临床特点及耐药情况,并进行统计学分析。结果:(1)菌种分布方面:本研究中分枝杆菌培养阳性菌株共3690株,共鉴定出NTM菌株302株,根据《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020年版)》最终诊断NTM肺病患者237例。NTM菌株中占比最高的菌种为胞内分枝杆菌(74.5%),其次为脓肿分枝杆菌(13.6%)和堪萨斯分枝杆菌(7.6%),对胞内和脓肿分枝杆菌肺病的防治仍是临床工作的重点。(2)人口学特征方面:本研究中237例NTM肺病患者平均年龄(62.5±13.6)岁,其中60岁以上老年人占比最高(57.8%)。通过进一步比较感染胞内分枝杆菌和其他分枝杆菌肺病患者的人口学资料特点,发现在性别、地域分布和城乡分布之间均无统计学差异(P值均>0.05),而在年龄分布上具有统计学差异,胞内分枝杆菌肺病老年患者占比高于其他NTM肺病患者(62.4%vs.42.9%,P<0.05)。(3)临床特征方面:NTM肺病可表现为咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、气喘、发热等,其影像特征包括肺结节、空洞、支气管扩张等。本研究发现支气管扩张占比较高,且肺部空洞以多发和薄壁空洞最为常见。NTM肺病的临床表现不具特异性,但进一步分析发现胞内分枝杆菌肺病合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)占比高于其他NTM肺病(16.6%vs.5.4%,P<0.05),胞内分枝杆菌肺病患者合并糖尿病的占比低于其他分枝杆菌肺病(P<0.05)。(4)耐药方面:对237株NTM进行药物敏感试验发现,NTM菌株对部分抗菌药物表现出高耐药率,如米诺环素、磺胺甲唑、多西环素的耐药率均超过90%。不同菌种对不同抗菌药物的耐药率不一。胞内和鸟分枝杆菌对阿米卡星和克拉霉素的耐药率均较低;脓肿分枝杆菌对乙胺丁醇、利福平、利福布汀、加替沙星高耐药,而对克拉霉素、头孢西丁和利奈唑胺的耐药率较低。结论:安徽地区NTM分离菌种以胞内和脓肿分枝杆菌为主,胞内分枝杆菌肺病与其他NTM肺病在人口学特点、临床特征和耐药性上具有不同之处,NTM对常用抗结核药物具有较高的耐药性。本项研究为安徽地区NTM肺病防控和治疗提供了参考,具有临床指导价值。

关键词： 刚地弓形虫   恶性肿瘤   膀胱癌   流行病学   生物学行为  

摘要： 目的:本研究通过检测大理地区恶性肿瘤患者弓形虫感染率,进一步丰富弓形虫感染数据库,为恶性肿瘤患者弓形虫感染防控提供参考依据。同时探讨弓形虫培养上清对恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响,旨在为恶性肿瘤的临床治疗提供新的思路。方法:1.收集2020年至2022年期间在大理大学第一附属医院接受治疗的721例恶性肿瘤患者的血清样本,同时收集100例健康体检者血清作为对照,采用酶联免疫吸附试验检测血清中抗弓形虫IgG及IgM抗体,比较分析不同类型以及不同特征恶性肿瘤患者抗弓形虫特异性抗体阳性率差异。2.取对数生长期的人膀胱癌5637细胞接种于细胞培养板中,实验组分别加入RH型及ToxoDB#9型弓形虫速殖子培养24 h后的上清液,对照组加入等体积的RPMI1640培养基。通过显微镜观察弓形虫培养上清干预后细胞的形态变化,采用CCK-8实验检测弓形虫培养上清对细胞增殖能力的影响,利用划痕愈合实验和Transwell实验检测对细胞的迁移和侵袭能力的影响,使用TUNEL实验检测对细胞的凋亡率的影响,通过Western blot实验检测对细胞中凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2表达情况的影响。使用统计学软件对实验结果进行统计分析以得出有效结论。结果:1.721例恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgG抗体阳性率为21.22%,高于健康对照组的8.00%(P<0.05),血清抗弓形虫IgM抗体阳性率与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)。不同类型恶性肿瘤中,胃癌、膀胱癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、子宫颈及子宫内膜癌与肝癌患者的血清抗弓形虫IgG抗体阳性率均显著高于健康对照组(P<0.05),子宫颈及子宫内膜癌患者血清抗弓形虫IgM抗体阳性率显著高于健康对照组(P<0.05),但不同类型恶性肿瘤患者的血清抗弓形虫IgG及IgM抗体阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。不同性别、年龄、民族、职业和居住地的恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgG抗体阳性率的差异均无统计学意义(P>0.05),不同性别、不同年龄恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgM抗体阳性率的差异有统计学意义(P<0.05)。2.(1)镜下观察细胞形态,弓形虫培养上清干预24 h后,与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组细胞量减少,细胞皱缩,核浆比例降低,核固缩、破裂。(2)在CCK-8实验中,弓形虫培养上清对5637细胞的增殖能力具有抑制作用,且ToxoDB#9组抑制率高于RH组(P<0.05)。(3)在划痕愈合实验中,24 h时对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率分别为(19.92±8.62)%、(11.80±3.18)%、(4.02±1.73)%,36h时对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率分别为(64.60±5.60)%、(17.57±4.24)%、(15.47±4.82)%。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组迁移率低于RH组(P<0.05)。(4)在Transwell迁移实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的迁移细胞数分别为(899.33±28.19)、(476.00±25.96)、(439.00±31.38)。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的迁移细胞数均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组迁移细胞数低于RH组(P>0.05)。(5)在Transwell侵袭实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的侵袭细胞数分别为(459.67±11.61)、(343.33±20.74)、(217.33±32.42)。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的侵袭细胞数均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组侵袭细胞数低于RH组(P<0.05)。(6)在TUNEL实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞凋亡率分别为(5.71±2.37)%、(74.35±5.88)%、(79.29±6.54)%。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞凋亡率均上升(P<0.05),且ToxoDB#9组凋亡率高于RH组(P>0.05)。(7)在Western blot实验中,与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞中Bax蛋白表达水平明显上升,Bcl-2蛋白表达水平明显下降,且Bcl-2/Bax比值下降,经统计学分析显示,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.大理地区恶性肿瘤患者弓形虫感染率显著高于健康对照者,但不同类型恶性肿瘤患者弓形虫感染率差异无统计学意义。恶性肿瘤患者弓形虫感染率不具有性别、年龄、职业、居住地和民族特异性。提示恶性肿瘤患者合并弓形虫感染较为常见,临床治疗时应加强对弓形虫感染的防治。2.弓形虫培养上清对膀胱癌5637细胞的增殖、迁移及侵袭能力有明显的抑制作用

关键词： 高度近视   PPEF2   全外显子测序   患病率   危险因素  

摘要： 目的:高度近视（High myopia,HM）是严重的致盲性眼病。近些年近视及高度近视发病年龄提前,患病率显著增加,遗传因素在HM的发生发展中起到重要作用。本研究拟调查新疆地区维吾尔族及汉族学生近视、高度近视患病率,分析相关危险因素。利用全外显子组测序（Whole exome-sequencing,WES）筛选维吾尔族非综合征性HM家系致病基因,并通过动物水平的建模及分子水平和细胞水平的实验,验证候选致病基因功能。以期填补新疆地区近视流行病学资料空白,丰富高度近视基因数据库,为高度近视的诊断和治疗提供依据。方法:第一部分:（1）采用多阶段分层随机抽样的方法进行横断面研究,在新疆地区84033名4-23岁汉族及维吾尔族学生中进行视力检查和非睫状肌麻痹自动验光检查。调查近视、高度近视患病率并计算年龄及性别调整患病率;（2）使用logistic回归模型分析近视及高度近视的危险因素。第二部分:（1）从流行病学调查发现的早发型高度近视维吾尔族儿童先证者入手,寻找到一个包含4代、19名成员（高度近视患者9名）的维吾尔族高度近视家系,进行详尽的眼科检查获取临床资料,绘制家系图谱;（2）对核心家系成员中的4名高度近视者和2名正常对照者进行全外显子组测序,结合生物信息学技术筛选高度近视相关致病基因;（3）利用Sanger测序在家系所有成员中进行候选基因的家系共分离验证,并验证二代测序的准确性;（4）在100例散发高度近视者与100例正常对照者中进行目标区域多重PCR扩增子测序,验证在高度近视家系中发现的致病基因和突变位点,在散发高度近视人群和正常对照人群中是否存在,并寻找致病基因其他的突变位点;（5）对发现的突变位点进行致病性预测、保守性分析、突变位点分布分析和突变蛋白模拟建模,以推测基因突变后对其编码蛋白结构和功能的影响。第三部分:（1）通过实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,q RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）实验,验证Ppef2基因（protein phosphatase with EF-hand domain 2）在小鼠眼球各个组织的表达情况;（2）构建PPEF2野生型、致病突变位点的点突变型慢病毒,分别瞬时转染人胚肾细胞（Human Embryonic Kidney 293T,293T）、稳定转染人视网膜上皮细胞（Adult Retinal Pigment Epithelial cell line-19,ARPE-19）构建稳定表达目的基因的细胞系;（3）通过q RT-PCR、WB和免疫荧光实验验证PPEF2突变对其在m RNA和蛋白水平的表达及亚细胞定位的影响;（4）通过划痕、CCK-8、平板细胞克隆形成实验、细胞流式检测凋亡及细胞周期实验来验证突变对细胞生物学行为的影响;（5）构建形觉剥夺性近视（Form deprivation myopia,FDM）小鼠模型,活体测量小鼠眼屈光度与眼部生物学参数确证模型构建成功。并利用q RT-PCR、WB、免疫荧光及免疫组化实验,初步验证Ppef2基因与近视表型之间是否有关联。结果:第一部分:（1）新疆地区总体近视的年龄及性别调整患病率为47.70%（95%CI:47.67-47.74）,高度近视的年龄及性别调整患病率为2.55%（95%CI:2.54-2.56）;（2）与维吾尔族学生相比,汉族的近视患病率（χ=5518.18,P<0.0001）和高度近视患病率（χ=300.51,P<0.0001）均较高,汉族的近视患病率是维吾尔族的2.12倍（57.01%vs 26.88%）,高度近视患病率是维吾尔族的近4倍（2.85%vs 0.72%）;（3）等效球镜（Spherical equivalent,SE）度数水平随年龄的增长而下降,近视和高度近视的患病率随年龄的增长而上升;（4）汉族、年龄、女性、高学历、居住在城市是近视及高度近视的危险因素。居住在北疆地区是近视的危险因素,但与高度近视的发病呈负相关。第二部分:（1）全外显子组测序在维吾尔族高度近视家系中筛选到一个符合家系共分离的PPEF2的罕见杂合错义突变c.875A>G（p.H292R）,且该突变在100例正常对照者中不存在;（2）目标区域多重PCR扩增子测序在100例散发高度近视患者中发现了PPEF2的其他罕见的杂合错义突变c.1959C>G（p.N653K）,该突变在100例正常对照者中不存在;（3）PPEF2基因c.875A>G（p.H292R）突变和c.1959C>G（p.N653K）突变均位于PPEF2蛋白重要的功能区和结构域中,高度保守,致病性

关键词： 侵袭性真菌感染   严重烧伤   流行病学   危险因素   预测模型  

摘要： 目的:分析严重烧伤后侵袭性真菌感染(Invasive Fungal Infection,IFI)流行病学特征,并探讨严重烧伤患者发生IFI的危险因素,建立Logistic回归预测模型,筛选出可能发生IFI的高危人群,从而针对高危人群早期干预,降低IFI发病率及死亡率。方法:采用回顾性巢式病例对照研究的方法,将南昌大学第一附属医院烧伤整形与创面修复医学中心2012年-2021年严重烧伤患者作为研究队列人群。依据IFI诊断标准分为IFI组和非IFI组,分析IFI组流行病学特征。将年龄>14岁发生IFI的106例患者作为病例组,再以性别一致,年龄±3岁,住院时长相对应(IFI患者所匹配的非IFI患者的住院时间至少不少于其入院至感染的时间间隔),按照1:2比例随机匹配212例未发生IFI的患者作为对照组。对两组患者进行单因素差异性分析法及多因素logistic逐步回归法分析,确定严重烧伤患者发生IFI的独立危险因素并建立预测模型。此外,采用霍斯默-莱梅肖(Hosmer-Lemeshow,H-L)评估预测模型的校准能力。使用受试者工作特征曲线ROC(Receiver Operating Characteristic,ROC)评估预测模型的效能。结果:1.流行病学:该研究包括1297名严重烧伤患者,其中166名患者被诊断为IFI,IFI的年发病率在7.87%-22.73%不等,总体呈上升趋势。热带念珠菌是IFI烧伤患者感染最主要病原体,白色念珠菌感染的占比在下降,非白色念珠菌感染的占比呈上升趋势。主要的几种念珠菌包括近平滑念珠菌、白色念珠菌及热带念珠菌对唑类抗真菌药物耐药率不低。因爆炸和电击致伤的患者IFI发病率更高,夏秋季入院的严重烧伤患者更容易发生IFI,且多集中在入院后的第2-3周内发生。2.多因素结果分析显示:糖尿病或应激性高血糖(OR=6.304,95%CI:2.691-14.767,P<0.001),留置尿管≥7d(OR=5.541,95%CI:1.863-16.483,P=0.002),肠外营养(Parenteral Nutrition,PN)≥5d(OR=2.679,95%CI:1.309-5.483,P=0.007),中心静脉置管≥3d(OR=2.319,95%CI:1.15-4.676,P=0.019),使用抗生素数量(OR=1.932,95%CI:1.399-2.669,P<0.001),使用抑酸剂(OR=4.729,95%CI:1.375-16.27,P=0.014),机械通气≥3d(OR=2.711,95%CI:1.271-5.784,P=0.01)、手术次数(OR=1.816,95%CI:1.353-2.439,P<0.001)、急性生理学及慢性健康状况评分系统Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Scoring SystemⅡ,APACHEII)(OR=1.205,95%CI:1.091-1.331,P<0.001)是IFI的独立危险因素,预防性使用抗真菌药物(OR=0.06,95%CI:0.023-0.155,P<0.001)是独立保护因素。3.预测模型:Logit P=-8.54+(1.841X)+(1.712X)+(0.985X)+(0.841X)+(0.659X)+(-2.816X)+(1.554X)+(0.186X)+(0.597X)+(0.997X)。X为糖尿病或应激性高血糖,X为留置尿管≥7d,X为PN≥5d,X为中心静脉置管≥3d,X为使用抗生素数量,X为预防性使用抗真菌药物,X为使用抑酸剂,X为APACHEII评分,X为手术次数,X为机械通气≥3d。H-L检验结果示P=0.644>0.05模型校准能力良好。ROC曲线的AUC=0.901,95%CI(0.878-0.941),P<0.001,模型预测能力良好。结论:***的发病率逐年呈上升趋势,主要菌种构成由白色念珠菌往非白色念珠菌转变,且非白色念珠菌对唑类抗真菌药物耐药。2.患有糖尿病或发生应激性高血糖、APACHEII评分较高,使用抗生素种类多、手术次数多及抑酸剂治疗,长时间留置尿管、PN、中心静脉置管、机械通气,是严重烧伤患者发生IFI的独立危险因素。3.基于上述独立危险因素构建的严重烧伤患者发生IFI风险预测模型经过验证,该模型表现出良好的预测性能,为临床干预减少IFI发生提供了指导。