关键词:
猪圆环病毒3型
双重PCR
流行病学调查
Cap蛋白
间接ELISA
摘要:
猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)为基因组2000nt的环状无囊膜DNA病毒。自2016年首次被发现以来,其流行性和危害性一直备受关注,目前在多个国家和地区均有发现且证实流行已久。为了解PCV3在我国西南地区的流行现状,特别是中小规模养殖场的流行情况,本试验首先建立PCV3与PC V2双重PCR鉴别诊断方法,对2020-2022年间四川省、贵州省和重庆市的部分中小型规模养殖场855临床样本进行检测,分析其感染情况,并通过对阳性样本全基因组的测定进一步揭示其分子遗传进化特征;而后以原核表达方式获得PC V3病毒主要结构蛋白Cap,以此建立检测其抗体的间接ELISA检测方法,并初步应用于三个省(市)的PCV3血清学感染情况的调查。本试验主要结果如下:***3和PCV2双重鉴别PCR方法的建立及对临床样本的检测分析PCV3与PCV2感染造成的临床症状相似且易混合感染,为了便于区分,本试验首先建立了一种快速、准确、特异性高的双重PCR检测方法,实现对PCV3与PCV2的鉴别诊断,结果所建立双重方法的其灵敏度分别为3.39×10copies/μL、6.63×10copies/μL,且与猪瘟等其它常见猪病原无交叉反应,能够用于临床检测;利用该方法对2020-2022年间收集的川渝黔部分地区中小规模猪场的临床样本进行检测。结果发现四川省阳性率1.15%(3/260),重庆市阳性率2.65%(8/302),贵州省阳性率0.34%(1/293),三省(市)总阳性率1.4%(12/855)。分析发现PCV3在三个省(市)的临床样本中以夏季流行较高,且多与PCV2混合感染。***3全基因组的测定与分析为进一步了解三个地区临床样本中PCV3的遗传进化情况,本试验对12份阳性样本进行全基因组分段扩增及测序,拼接得到12株完整序列并对其进行分型,同时使用DNA Star和MEGA软件以比邻法构建同源性矩阵和系统发育进化树。结果显示所获PCV3主要为3a型(7株),其次是3b型(3株)和3c型(2株)。同源进化分析显示全基因组核苷酸和蝙蝠源圆环病毒同源性较高,与国内各省份猪源PCV3遗传变异较低;其中Rep蛋白和Cap蛋白与水禽圆环病毒均高度相似。***3 Cap蛋白的原核表达及鉴定Cap蛋白作为圆环病毒的结构蛋白具有良好的免疫原性,因此本试验对所获PCV3的Cap蛋白进行原核表达。首先通过对PCV3 Cap的生物信息学分析,选取最佳片段并使用p ET32a载体进行重组质粒构建,再以能提高稀有密码子表达的Rosetta宿主菌进行p ET32a-Cap原核表达,探索最佳表达条件为终浓度0.5m M/L的IPTG于37℃诱导4h。经过Western Blot验证、镍柱纯化,证实成功表达并纯化了p ET32a-Cap重组蛋白,且能与PCV3临床阳性血清反应。4.基于PCV3 Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用将纯化复性的p ET32a-Cap蛋白为抗原,通过优化条件初步建立血清PCV3抗体间接ELISA检测方法,使用最佳抗原浓度为1μg/m L,封闭液为5%脱脂奶粉,待检血清10倍稀释,酶标二抗羊抗猪Ig G-HRP作1:5000稀释,以TMB显色反应,判断标准为OD吸光值S/P值大于0.224时为阳性。该方法变异系数均小于10%,与CSFV、PCV2、PRRSV和PRV等抗体血清均无交叉反应,特异性良好。初步应用发现四川省的3个养殖场PCV3抗体阳性率为72.1%(158/219);重庆市3个养殖场为81.9%(149/182);贵州省5个养殖场为57.1%(97/170),三个省(市)总阳性率71.4%(404/571)。综上所述,本试验建立了PCV3和PCV2的双重鉴别PCR检测方法,丰富了近年来川、黔、渝地区中小型规模养殖场近年来PCV3的感染数据;利用PCV3重组Cap蛋白建立了PCV3抗体检测的间接ELISA方法,从血清学角度进一步了解PCV3的感染状况,为PCV3的防控提供技术支撑。