关键词:
黄曲霉毒素B1
枯草芽孢杆菌
毒素降解
摘要:
【目的】筛选出能够高效降解黄曲霉毒素(aflatoxin, AF)的菌株,并对其降解活性及残留毒性进行检测,以期为黄曲霉毒素B1(alflatoxin B_(1),AFB_(1))污染防治提供参考。【方法】采集耗牛、绵羊等草食性动物粪便和养殖场霉变饲料,以AFB_(1)的结构类似物香豆素为唯一碳源筛选降解AFB_(1)效率最高的菌株,并对其进行形态学、生理生化和16S rDNA鉴定。取AFB_(1)与适量筛选菌株的发酵液混合,使AFB_(1)的浓度为1μg/mL,37℃、150 r/min培养,测定培养不同时间AFB_(1)降解率;应用差速离心法分别制取上清液、菌悬液和菌体,将菌体超声裂解后制得胞内液,测定不同组分对AFB_(1)的降解率;对上清液分别进行蛋白酶K、蛋白酶K+SDS和热处理,检测处理后上清液AFB_(1)降解率;分别用不同浓度的饱和硫酸铵沉淀处理上清液,检测AFB_(1)降解率;应用7 ku透析袋对上清液进行浓缩,检测AFB_(1)降解率,从而判断菌株活性成分的性质和分布。将鸡肝细胞分为AFB_(1)组、AFB_(1)-菌株组、菌株组和空白对照组,用实时荧光定量PCR检测各组鸡肝细胞中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosisi factor alpha, TNF-α)和Bcl-2-associated X蛋白(Bax)基因的相对表达量。【结果】经初筛和复筛,从编号为S1的绵羊粪便样品中分离出1株菌株,其降解AFB_(1)的活性最高,降解率可达60.36%。菌株S1在LB固体培养基上培养12 h,可观察到淡黄色不透明菌落,表面光滑,有隆起,镜检革兰氏染色呈阳性,杆状。16S rDNA基因进行PCR扩增并进一步测序分析,其序列与LC55966.1的同源性为100%。综合16 S rDNA序列分析和生理生化结果鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌发酵液与AFB_(1)(1μg/mL)反应4、12、24、48和72 h,降解率分别达到10.98%、25.36%、46.24%和52.65%和80.84%。上清液AFB_(1)降解率显著高于菌悬液和胞内液(P<0.05)。热处理后,上清液的AFB_(1)降解活性降低,而经蛋白酶K和SDS处理后降解活性基本丧失。用不同浓度饱和硫酸铵处理的上清液AFB_(1)降解率差异不显著(P>0.05),而经透析浓缩后的上清液AFB_(1)降解率显著高于硫酸铵处理的上清液沉淀蛋白(P<0.05)。在鸡胚胎肝脏原代细胞上,与AFB_(1)组相比,AFB_(1)经枯草芽孢杆菌S1降解后诱导IL-6、TNF-α以及Bax的表达量均显著降低(P<0.05)。【结论】筛选到1株枯草芽孢杆菌S1,其具有较高的降解AFB_(1)的活性,其降解活性主要来自于培养液上清中的蛋白质;AFB_(1)经降解后其毒素显著降低。