关键词： 钛基复合材料   黄曲霉毒素B1   光催化降解   核酸适配体   密度泛函理论   花生油品质   降解机制   安全性评价  

摘要： 黄曲霉毒素B(AFB)非常容易出现在农产品、饲料以及食品加工、贮藏过程中,严重威胁粮油食品安全,这种毒素具有致癌性,对人和动物健康影响极大,因此如何保障食品及饲料的安全以及有效的对AFB进行降解脱毒成为目前热点问题。众多光照降解技术中,光催化因其使用过程简易、无再次污染、可直接利用太阳光、降解彻底和运行成本低等优点,被国内外学者广泛研究。目前,水中污染物以及染料的降解、净化工作均广泛应用该技术,发展潜力十足。但是,Ti O基光催化剂自身选择性和专一性较差,在复杂的油脂体系中,可能会引起油脂中有机组分的改变或破坏。核酸适配体(Aptamer)作为一种低成本的新型分子识别元件,被誉为“人工抗体”,是近年来研究的热点之一。由于核酸适配体具有三维结构,它们可以特异性结合多种目标,如金属离子、有机物、蛋白质以及细胞。为实现对低浓度目标污染物的选择性降解,本课题使用核酸适配体介导磁性氧化石墨烯/二氧化钛(MGO/Ti O-aptamer)钛基复合材料,对AFB进行光催化选择性降解性能、光催化降解花生油中AFB及对油脂品质影响、光催化降解AFB降解路径与机制以及光催化降解产物安全性等方面的研究。具体研究内容如下:1、水热合成法成功制备MGO/Ti O复合材料,通过核酸适配体的氨基与MGO/Ti O的羧基共价结合制备MGO/Ti O-aptamer,并借助扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱和透射电镜等方法对MGO/Ti O-aptamer进行表征,结果表明MGO/Ti O-aptamer制备成功。由于Aptamer的介导,使MGO/Ti O-aptamer复合材料具有对低浓度AFB降解增强效果及选择性降解混合体系中AFB能力。在紫外可见光照射下,当添加量为6 mg,在p H=3环境中光照120 min后,MGO/Ti O-aptamer对AFB降解率可达98.3%,且其光催化降解过程符合准一级动力学模型。MGO/Ti O-aptamer在重复使用4次后,对AFB溶液的降解率仍达80%。羟基自由基(·OH)与价带空穴(h)在MGO/Ti O-aptamer降解AFB过程中起主要作用。2、以花生油为反应体系,对含AFB1的花生油样品进行紫外可见光照射处理,结果显示,MGO/Ti O-aptamer复合材料对花生油中低浓度AFB降解有增强作用,在紫外可见光照射下,向AFB含量为40μg/kg的花生油中添加8 mg光催化剂,降解120 min时降解率为77.3%,降解后毒素浓度约为9.08μg/kg,且其光催化降解过程符合准一级动力学模型。光催化过程中,花生油的酸价和过氧化值均有增加趋势,但幅度极小,碘值在光照60 min后才有明显的降低,但都处于国家限量范围标准内。花生油中脂肪酸组成并没有明显改变,甾醇和维生素E含量变化幅度较小。3、利用HPLC-MS/MS技术对光催化降解产物进行结构分析,推测三种降解产物结构式及分子式,分别为P1(CHO)、P2(CHO)、P3(CHO)。通过DFT理论对复合材料结构及物理性质进行分析,研究光催化降解过程可能的降解路径及机制,其中自然键轨道(NBO)表明AFB的C9(No.C31号原子)的自然电荷为-0.28901,负电荷比C8(No.C29号原子,0.12138)更多,前线分子轨道理论对光催化材料、AFB与羟基自由基(·OH)的计算结果表明,光催化剂的改造使其活性不断提高、电子更容易跃迁、更容易被紫外可见光激发,核酸适配体的介导并未对MGO/Ti O材料的分子活性造成明显影响,且AFB的LUMO与·OH的β-HOMO之间的相互作用最大,能隙低至?E=0.047e V,二者前沿轨道间相互作用极强。推测·OH的加成反应优先发生在AFB的C8=C9双键上,其中·OH最有可能与C9位置发生相互作用。通过降解产物能量分析,证明推测的降解产物结构具有合理性,且同样验证·OH最可能与C9位置发生相互作用。4、通过Ames实验与斑马鱼模型实验对光催化降解AFB产物进行毒性分析,结果表明,甲醇体系与花生油体系中光催化降解AFB产物对鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100的回复突变数显著小于相同剂量AFB对菌株的回变菌落数,甲醇体系中降解产物与阴性对照组回复突变率几乎无差异,但花生油体系中降解产物回复突变率与阴性对照组相比具有一定差异性,可能是花生油复杂的成分使AFB降解不完全所导致。斑马鱼仔鱼经过80 ng/m L的AFB诱导至96 hpf时后存活率为74%左右,并出现肝脏、卵黄囊发黑迹象,卵黄囊因仔鱼吸收变差而肿大,脊柱与尾部出现弯曲现象,而降解产物实验组的斑马鱼仔鱼存活率为100%,肝脏与卵黄囊状态良好,脊柱与尾部未出现弯曲现象。鱼体匀浆后的上清液测定结果表明,AFB导致斑马鱼仔鱼肝功能严重受损,仔鱼肝脏内乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷

关键词： 黄曲霉毒素B1   传感器   电化学   检测   便携式  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是农副产品中最常见的真菌毒素之一,已被确定具有诱变性、致畸性、免疫抑制性等多种有害性质。传统的AFB1检测方法包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(ELISA)等,但这些检测手段有的需要专业的操作人员和大型昂贵的设备,有的检测样本需要进行复杂的处理,不能满足现场快速检测的需求。电化学传感器成本低、体积小并且灵敏便携,适用于便携式设备的研发。因此本研究以电化学传感技术为基础,首先制备出一款能够用于检测AFB1的电化学传感器,然后以STM32F103ZET6为核心搭建硬件电路,最后在Lab VIEW平台开发上位机软件,完成了一套可以用于实际样品AFB1检测的便携式系统。本研究的主要内容如下:(1)AFB1电化学传感器的制备。为了实现实际样品中AFB1的检测,制备了一种以AFB1适配体为识别元件的传感器。以丝网印刷电极(SPE)为基底电极,逐层修饰石墨烯与碳纳米管的混合材料(COOH-GO-COOH-MWNT)、聚多巴胺(p DA)、金纳米粒子(Au NPs),制备的传感器可以在0.1 fg/ml～100 pg/ml范围内对AFB1进行检测。牛奶样本测试回收率在96.8%～106%之间,表明传感器具备实际应用潜力。(2)便携式检测系统的硬件和软件的设计。首先以STM32F103ZET6为核心,搭建DPV波形生成电路、恒电位电路和微电流检测模块,以及完成PCB设计与制作;然后配置数模(DA)转换、模数(AD)转换与串口模块的驱动程序以及下位机的软件流程;最后使用Lab VIEW开发上位机软件,能够降噪处理数据、图形化显示数据并能够计算AFB1浓度。(3)系统性能测试。设计相关实验,验证硬件电路各个模块的准确性,DPV波形生成电压的理论输出与实际测量值的线性相关系数为0.99;恒电位电路设定值与实际测量值最大偏差不超过4 m V;微电流检测模块理论放大电压与实际测量值最大偏差不超过54m V,证明硬件电路可以满足要求、精度够高。之后将整个系统组合到一起,采用标准溶液和实际样本验证整个系统的检测性能。标准溶液中,便携式系统与电化学工作站比较相对误差最大为7.37%,实际花生油的回收率在96.8%～106.0%和花生样本检测时,便携式系统和工作站相比相对误差不超过7.10%。证明整个检测系统在实际样本检测中有较大的应用潜力。

关键词： 桃蛀螟   黄曲霉毒素B1   细胞色素P450   酶活性   实时荧光定量PCR   RNA干扰  

摘要： 桃蛀螟Conogethes punctiferalis是近年来在我国夏玉米田严重为害的主要害虫之一。除直接蛀食玉米籽粒、穗轴和茎秆外,桃蛀螟幼虫为害玉米雌穗造成的伤口还易遭受穗腐病病菌的侵染,从而引起穗腐病发生加重,严重影响玉米产量和品质。在我国,玉米穗腐病致病菌的优势种之一便是黄曲霉菌Aspergillus flavus,该致病菌不仅能引起玉米穗腐病发生,还能产生黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)并存留于玉米籽粒中,成为粮食、饲料、食品中常见的有毒污染物,严重威胁人畜健康,是影响玉米食用和饲用安全的重要制约因子。研究表明,AFs的多种同分异构体中,以AFB毒性最强,具有很强的致癌、致畸和致突变作用,会导致人和动物免疫受到抑制、不孕、先天畸形、内分泌紊乱等,在国际上被列为Ⅰ类致癌物。本课题组前期研究发现,桃蛀螟幼虫对不同寄主的适应性较强,即使在穗腐病发生严重的玉米上也能够很好地完成生长发育,说明其对穗腐病玉米具有较强的适应能力。本文利用室内毒力测定、生命表、酶活检测等方法,探明AFB对桃蛀螟的生长发育和体内相关解毒酶活性的影响。之后从课题组前期转录组测序结果中挑选出两条细胞色素P450基因CYP321F5和CYP9A79进行基因克隆,并对其进行表达量分析及RNA干扰,分析相关P450基因在桃蛀螟适应AFB的过程中的作用。期望能够阐明桃蛀螟幼虫耐受AFB的内在机理,为后期进一步探究桃蛀螟对AFB解毒代谢的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:(1)利用饲料混毒法测定了AFB对桃蛀螟初孵幼虫和3龄幼虫的毒力水平。结果表明桃蛀螟初孵幼虫和3龄幼虫对AFB具有较强的耐受性,该毒素对桃蛀螟初孵幼虫的LC为37.381mg/kg,3龄幼虫的LC为101.996 mg/kg。(2)采用生命表试验研究不同浓度AFB对桃蛀螟生长发育的影响。当饲料中AFB浓度≥4mg/kg时,随着AFB浓度的升高,桃蛀螟幼虫的发育历期明显延长,且化蛹率和蛹重明显降低;当饲料中AFB浓度≤1 mg/kg时,与对照相比,桃蛀螟幼虫仍能完成正常的生长发育。说明桃蛀螟幼虫能够耐受一定范围内的AFB,该耐受剂量显著高于玉米中AFB的国家安全标准检测。(3)利用生命表试验研究饲料中添加P450抑制剂PBO后,对AFB对桃蛀螟毒性的影响。发现当桃蛀螟取食同时含有PBO和AFB的饲料时,与取食只加相同剂量的AFB饲料相比,其生长发育受抑制情况更为显著,显著增强了AFB对桃蛀螟的毒性。表明该虫体内细胞色素P450酶对AFB的代谢作用强于活化作用。(4)利用酶活性检测试剂盒分析了AFB对桃蛀螟中肠内细胞色素P450酶(CYP450s)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和羧酸酯酶(Car E)活性的影响。发现桃蛀螟3龄幼虫取食添加LC剂量的AFB饲料24 h、48 h、72 h和96 h后,其中肠内的CYP450s和GSTs酶活性均明显高于取食对照饲料的幼虫;取食48 h、72 h和96 h时,其中肠内的Car E的酶活性显著上升,说明CYP450s、GSTs和Car E可能参与了桃蛀螟对AFB的解毒代谢过程。(5)通过PCR技术成功克隆出了桃蛀螟体内受AFB影响较大的两个CYP450s基因CYP321F5和CYP9A79。结果显示,CYP321F5基因ORF全长1377 bp,编码458个氨基酸,蛋白质分子量约为52.635 k Da,等电点为8.42,在Gen Bank上核苷酸登录号为OQ406257.1,氨基酸登录号为WCQ76343.1,系统发育分析表明,其与稻纵卷叶螟CYP321F5的亲缘关系较近,氨基酸同源性为73.58%;CYP9A79基因ORF全长1467 bp,编码488个氨基酸,蛋白质分子量约为56.360 k Da,等电点为6.45,在Gen Bank上的核苷酸登录号为OQ406258.1,氨基酸登录号为WCQ76342.1,系统发育分析表明,与稻纵卷叶螟CYP9A79的亲缘关系较近,氨基酸同源性为71.17%。CYP9A79氨基酸序列含有P450的五大保守结构域,但CYP321F5缺失了位于螺旋I区的保守序列A/GG×D/ETS/T,并且位于血红素结合区的特征序列被FGYGQRATRD替代。(6)采用Real-time PCR技术对AFB处理后桃蛀螟中CYP321F5和CYP9A79基因的表达情况进行了分析。结果显示,桃蛀螟3龄幼虫取食添加了AFB(饲料中AFB浓度为其LC)的饲料24 h、48 h、72 h、96 h后,CYP321F5的表达量均明显高于对照组,其中,幼虫取食96 h时,对该基因表达量的影响最为强烈,处理组的表达量是对照组的3.31倍;CYP9A79的表达量也在幼虫取食AFB饲料72 h、96 h时显著上升,表达水平分别为对照的1.49

关键词： 虾青素   黄曲霉毒素B1   IPEC-J2细胞   氧化应激   细胞凋亡   Nrf2信号通路  

摘要： 虾青素(AST)属于类胡萝卜素中的叶黄素类,具备强抗氧化性。黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种在饲料中常见的真菌毒素,有强烈毒性,氧化应激是它发挥毒性的主要途径之一,找到一种合适的抗氧化剂是缓解其毒性的有效措施。猪对AFB1特别敏感,并且AFB1会对肠道造成严重损伤。因此,本研究以IPEC-J2细胞为研究对象,目的是探究AST能否缓解AFB1对IPEC-J2细胞的损伤及具体机制。本研究共两部分研究内容,研究一是AST对IPEC-J2细胞的影响,研究二是AST缓解AFB1对IPEC-J2细胞的损伤作用。不同浓度的AST(0、5、10、20、40、80和100μM)处理细胞24 h后,通过CCK-8测定细胞活力。结果表明AST(5～100μM)对IPEC-J2细胞活力是无显著差异,细胞活力未下降。通过超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测SOD活性以及利用q-PCR技术检测总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)的基因表达量评估AST对IPEC-J2细胞抗氧化能力的影响。结果表明,与对照组(未添加虾青素)相比,随着AST浓度的增加,SOD活性显著上升,T-SOD和CAT基因表达量也显著增加,这表明AST能够增强IPEC-J2细胞的抗氧化能力(P<0.05)。与对照组比较,AST组肿瘤坏死因子(TNF-α)、髓分化因子88(My D88)和白细胞介素1β(IL-1β)的基因表达量在AST(10μM)之后显著下降(P<0.05)。与对照组相比,在AST(20μM)之后,半胱天冬蛋白酶9(Caspase-9)基因表达量和Bcl-2相关x蛋白(Bax)/B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)比值显著下降,80μM的AST可以显著降低Bax蛋白表达量和Bax/Bcl-2蛋白表达量比值(P<0.05)。AST是Nrf2激活剂,Nrf2又是调节抗氧化功能的重要转录因子。AST作用IPEC-J2细胞后,检测到Nrf2通路受到AST的影响被激活。AST浓度的增加使Nrf2基因表达量逐渐增加,Nrf2下游抗氧化基因血红素加氧酶1(HO-1)、NADH:醌氧化还原酶1(NQO-1)、热休克蛋白70(HSP70)和超氧化物歧化酶2(SOD2)基因表达量被显著提升,AST(80μM)显著增加Nrf2和HO-1蛋白水平(P<0.05)。总之,AST(5～100μM)对IPEC-J2细胞是无毒害作用的,可以激活IPEC-J2细胞Nrf2信号通路,其中AST(80μM)对细胞抗氧化、抗炎和抗凋亡能力提升效果更为稳定,效果更好。不同浓度的AFB1(1、5、10、20、40和80μM)处理IPEC-J2细胞24 h后,细胞活力从AFB1(5μM)开始出现显著下降(P<0.01),AFB1(10μM)导致细胞活力下降到80%左右,之后选择10μM的AFB1进行试验。根据之前研究结果,将AFB1(10μM)与AST(5、10、20、40、80和100μM)共同处理细胞,结果表明,与AFB1组相比,AST(80μM)显著提升由AFB1(10μM)引起的IPEC-J2细胞活力的降低(P<0.01)。因此,后续试验选择AFB1(10μM)和AST(80μM)共同作用于IPEC-J2细胞,分为3个处理组,对照组、AFB1(10μM)组和AFB1(10μM)+AST(80μM)组。与对照组相比,AFB1组显著增加LDH、ROS以及MDA水平,降低SOD和GSH的活性。然而,与AFB1组相比,AST的添加使得LDH和ROS水平显著下降(P<0.05),MDA含量也出现下降趋势,但无显著差异。与AFB1组相比,AFB1+AST组中SOD和GSH活性被显著提升。使用流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果表明,与对照组相比,AFB1显著增加细胞凋亡率,而AST的补充显著降低凋亡率(P<0.01)。与对照组相比,AFB1组的促凋亡蛋白包括细胞色素C、Bax、Bax/Bcl-2比率和Caspase-3蛋白表达量显著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著下降。而与AFB1组相比,AFB1+AST组逆转了上述相关凋亡蛋白表达趋势(P<0.05)。较对照组而言,AFB1诱导IPEC-J2细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达量显著下降,Nrf2下游基因包括NQO-1、SOD2和HSP70,它们的表达量在AFB1的作用后显著下降。与AFB1组比,AST成功激活Nrf2通路,显著增加Nrf2、HO-1、SOD2和HSP70基因表达量,NQO1也呈现上升趋势,同时,也显著提高Nrf2和HO-1蛋白表达量(P<0.05)。总之,结合AFB1(10μM)引起IPEC-J2细胞发生氧化应激和凋亡损伤来看,AST(80μM)可以通过激活Nrf2信号通路来减轻这些危害。综上所述,通过以上研究明确AST对AFB1诱导IPEC-J

关键词： 医疗机构中药制剂   传承创新发展   法治保障   完善路径  

摘要： 医疗机构中药制剂,特别是作为“独家秘方”的中药复方制剂,是我国医疗卫生行业的特色产物,作为市售药品的补充,其“简、便、验、廉”的特点有效地满足了病患的需求、弥补了市场空缺,在疾病治疗中发挥无可取代的作用。但其行业自建国以来从产生、发展到萎缩,走到如今,医疗机构中药制剂行业在困境中徘徊,如何通过传承创新发展的法治保障举措促进医疗机构中药制剂行业发展亟需进一步的系统研究。第一章首先从医疗机构中药制剂的来源与发展入手,介绍了与医疗机构中药制剂相关的概念释义与医疗机构中药制剂的监管历程,分析了医疗机构中药制剂行业受国家政策影响在各个时代发挥的作用与发展状况。对医疗机构中药制剂相关的政策法规颁布情况进行梳理,将医疗机构中药制剂发展进程分成四个历史时期——鼓励发展期(1950-1985)、蓬勃发展期(1985-2000)、规范发展期(2000-2010)、创新发展期(2010-至今)。在鼓励发展期,由于市场上药品稀缺,因医疗机构中药制剂能满足临床用药需求,故政策上和实践中对制剂的要求并不那么严格设限,医院都在大力开发和制作医疗机构中药制剂;在蓬勃发展期,出于改革开放与市场经济体制改革带来了医院效益机制的转变,作为医院的特色,医疗机构中药制剂获得了医院的大力支持,剂型和品种均有极大的创新与发展;但在蓬勃发展的同时,医疗机构中药制剂的质量和不良反应事件频发,名为院内制剂却在院外肆意流通,引起药品管理的混乱,人民医疗安全不能得到保障;在2000后,国家就开始对医疗机构中药制剂室设限,通过设置门槛与标准来规制医疗机构中药制剂的发展;后因政策出台的标准过于严苛,医疗机构中药制剂行业发展一蹶不振;后为促进中医药事业与中药新药的研究与发展,国家发布促进医疗机构中药制剂传承创新的政策,医疗机构中药制剂行业逐渐恢复生机。第二章北京市医疗机构中药制剂法规政策梳理与现状分析。目前北京市医疗机构中药制剂行业发展是较为缓慢的,通过梳理法规政策,指出北京市颁布的法规政策体系存在的一些问题与漏洞。其一,在传承方面,北京市《中医药条例》当中相关鼓励政策较少,法规修订不及时,北京市名老中医经验方评估开发保护机制阙如;其二,在创新方面,北京市发布的促进政策缺乏产业思维,虚置立法空间,知识产权保护体系缺位,致使新药转化动力不足;其三,在发展方面,北京市医疗机构中药制剂监管运行机制缺乏动态、连续的监管,法规规制目标单一,难以回应现实需求。第三章传统药物规制模式的法治考察与经验借鉴。介绍分析了日本、印度、欧洲、韩国等地的传统药物规制模式与药物注册简化办法,总结出可供我国借鉴的经验与规律。包括设置相对独立的规制机构与分类监管等级、知识产权保护的专门化和尊重对历史经验和规律的总结,简化传统药物的注册管理等。第四章促进北京市医疗机构中药制剂行业传承创新发展的法治保障路径构建。从重塑医疗机构中药制剂行业法治保障原则与思路出发;在传承方面,法治引航做好北京市医疗机构中药制剂传承工作;在创新方面,建立医疗机构中药制剂研发激励机制、完善符合中药院内制剂特点的知识产权保护机制;在发展方面,建立质量标准,及时修订更新监管规范等;在配套保障方面,多措并举以法治力促北京市医疗机构中药制剂传承创新发展等五个方面,提出对策建议,寻求多主体、多层次的合作治理以强化法治保障能力。

关键词： 黄曲霉毒素B1   核酸适配体   荧光分析   分子信标   食品安全  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种毒性很强的天然真菌毒素,常见于发霉和腐烂的谷物及其制品中。由于其强烈的致癌性,AFB1已被世界卫生组织癌症研究机构(IARC)列为I类致癌物质,严重威胁着人类食品安全和身体健康。AFB1检测工作对预防相关污染和危害事件的发生具有重要意义。传统的AFB1检测方法受限于复杂的样品前处理程序和大型仪器设备,分析时间长,成本高,不适用于现场即时检测。因此,有必要开发新型的AFB1检测方法,本文以新兴的适配体作为AFB1分子识别元件,联合分子信标传感技术,构建了适合于现场快速检测AFB1的简便方法,主要研究内容如下:(1)AFB1适配体功能结构表征及优化。以圆二色光谱技术为研究手段,对AFB1适配体的功能结构进行了研究,阐明了其关键功能结构和非必要核苷酸序列,并对原始适配体序列和结构进行了裁剪优化。优化后的适配体结构更加简单,亲和力更高,可用于圆二色法快速检测AFB1,检测限达到0.6n M。(2)快速检测AFB1的适配体分子信标方法。在互补DNA(c DNA)链的协助下,两端标记荧光素FAM和猝灭剂BHQ1的DNA适配体分子信标,对AFB1的荧光响应更大。通过实验条件优化,该方法在20 min内实现了快速检测AFB1。检测范围为1 n M～3μM,检测限为1 n M,低于在没有c DNA辅助下获得的检测限(8 n M)。这种基于适配体的分子信标检测方法具有操作简单、分析快速、信号响应较大等优点。(3)基于非标记适配体结构变化快速检测AFB1。不存在AFB1时,非标记的适配体能够同时与两条短互补DNA链杂交,形成DNA双链结构。此时,标记在其中一条互补DNA的3’端的荧光素(FAM),与标记在另一条互补DNA的5’端的猝灭剂(BHQ1)相靠近,发生荧光共振能量转移,FAM荧光被猝灭。当AFB1存在时,适配体与AFB1结合,而不与互补DNA发生杂交。此时,FAM与BHQ1距离较远,FAM荧光不能被猝灭。通过测量体系荧光强度大小,实现了AFB1的定量检测。检测范围为1 n M～4μM,检测限达到1 n M。此方法无需适配体标记,成本更低,背景信号更低,荧光强度随着AFB1浓度增大而增大。

关键词： 黄曲霉毒素B1   农产品   纳米体系   预防   吸附   光催化  

摘要： 农作物真菌病害是影响农作物稳产增产的重要因素,病原真菌产生的真菌毒素造成了世界范围内的粮食和农产品的巨大损失,极大阻碍了农业的绿色可持续发展,成为全球粮食安全的重大威胁。黄曲霉毒素是一类主要由曲霉属真菌(Aspergillus sp.)产生的以双呋喃环香豆素为骨架的真菌毒素,包含B、G和M族等十余种毒性化合物,其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)具有强烈的致癌性、致畸性、致突变性和急性肝毒性,是在农产品中存在最广泛、危害最严重的真菌毒素之一。因此,关于AFB1预防和脱除技术的研究已成为食品安全和农业领域的研究热点。近年来,纳米技术由于其在尺寸定制、功能化修饰和理化稳定性等方面的优势在农业领域中的研究发展迅速,在农药控释、土壤修复和病原物治理等方面显示出巨大的应用潜力,也为真菌毒素预防和脱除提供了新的策略。据此,本文设计并构建了三种功能化的纳米体系,分别用于农产品中AFB1的绿色防治,吸附脱除和光催化降解。研究内容和结果如下:(1)以Tween-80为表面活性剂,通过高压均质化技术制备了一系列基于不同比例美国薄荷和栉叶蒿精油的纳米乳剂,并通过动态光散射、扫描电镜和高速离心法对它们的形态、尺寸和稳定性进行了表征。所制备的纳米乳剂(命名为MNEO 1-5)对高毒性菌株Aspergillus flavus CF-79具有显著的生长抑制作用,并降低高温和潮湿储存环境下花生中AFB1的积累量,其中,美国薄荷精油含量最高的纳米乳剂(MNEO-1)活性最为突出(IC50=4.70 mg g–1)。通过气相色谱-质谱检测证明百里酚是美国薄荷精油中的主要成分(92.3%),进一步验证了百里酚对*** CF-79具有显著的生长抑制效果(IC50=14.5 mg L–1),并引发菌丝体中活性氧的积累和细胞膜损伤。利用高通量转录组测序筛选百里酚处理下*** CF-79中的差异表达基因,根据富集分析揭示了百里酚能通过调控多种代谢途径增强菌丝细胞的三羧酸循环,并诱导ROS积累,从而导致细胞死亡;同时,百里酚可能通过下调黄曲霉毒素生物合成通路中炔诺酮单加氧酶等酶活性以减少AFB1的产生和积累。以药(食)用植物精油开发的防控剂型可能是解决农产品保存过程真菌毒素污染问题的最安全有效的策略。(2)通过溶剂水热法合成了具有多孔结构和优异分散性的金属有机框架(MOF)材料MIL-101(Fe),研究其作为吸附剂对AFB1的去除能力。对不同条件下MIL-101(Fe)对AFB1的吸附性能开展了试验,并结合吸附热力学、吸附等温线模型和吸附动力学模型对吸附过程进行解析。结果表明:MIL-101(Fe)吸附剂稳定性强,而且与已经报道的其他吸附剂相比,MIL-101(Fe)对AFB1表现出更加优越的负载能力(30.58 mg g–1)。同时,利用分子对接和计算化学手段建立了AFB1分子与MIL-101(Fe)配体之间的相互作用模型。此外,通过表面疏水性修饰制备了TMCS-MIL-101(Fe),改善了材料在疏水相中的分散性,进而实现了对花生油中AFB1的有效去除。这项工作为农产品中AFB1的去除提供了一种简单有效的途径。(3)我们设计了一类基于MOF材料的具有多种组合模式(SS型,SL型和LS型)的Fe3O4@Ui O-66磁性纳米体系用于AFB1的脱除。得益于Ui O-66的多孔结构和Fe3O4的光催化增强效应,复合体系实现了对AFB1的高效吸附和光催化降解(90%以上)。此外,SL-和LS-Fe3O4@Ui O-66催化剂在外部磁场的作用下具有极高的回收率,并且在三次循环后仍保持80%以上的脱除能力。电子顺磁共振波谱检测表明,在光催化过程中产生了大量的羟基自由基,致使AFB1结构中C8=C9双键被破坏,从而降低其毒性。为了进一步考察光催化脱毒的可靠性,利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对11种产物进行了分析,并通过核磁共振技术确定了其中7种主要产物的结构,随后根据AFB1及其光催化产物的结构特征,提出了可能的光催化反应机理,同时,利用LO-2细胞系评估了7种主要产物的细胞毒性。研究表明:具有吸附效应和光催化协同作用的Fe3O4@Ui O-66体系是一种AFB1脱除的可靠手段,为开发具有磁性回收能力的新型真菌毒素光催化剂开辟了新的途径。本文研究将为农产品中AFB1的防治提供参考,为开发绿色、高效的新型真菌毒素防控技术提供理论支撑,对于农业的可持续发展具有重要的现实意义。

关键词： 乌鳢   α-硫辛酸   黄曲霉毒素B1   肝损伤   Nrf2信号通路  

摘要： 黄曲霉毒素B(AFB)是一种毒性和致癌性最强的黄曲霉毒素(AF),其在肝脏中代谢产生的有毒物质可引起肝脏结构损伤及功能障碍。水产饲料中植物蛋白的大量应用、全球气候多变及饲料加工或贮存不当均导致水产饲料及其原料极易被AFB污染,进而严重威胁水生动物的肝脏健康。然而,关于AFB诱导鱼类肝损伤的作用机制尚无定论,缺乏系统性研究。α-硫辛酸(α-LA)是一种条件性必需营养素,具有抗氧化、抗炎及保护肝脏等作用,并且能够有效的缓解霉菌毒素对畜禽动物的毒性作用。但α-LA对AFB诱导鱼类肝损伤的保护作用及其分子机制尚不明确。因此,本研究以乌鳢为试验对象,使用RNA-Seq等技术探究AFB诱导乌鳢肝损伤的潜在分子机制。此外,运用营养干预手段,以α-LA为功能性饲料添加剂,通过体内和体外试验,利用免疫学、细胞生物学、分子生物学及营养学等方法,揭示α-LA缓解AFB诱导乌鳢肝损伤的作用机制。主要研究结果和结论如下:(1)基于转录组学揭示AFB诱导乌鳢肝损伤的潜在机制为评估AFB对乌鳢的毒性作用及其诱导肝损伤的潜在机制,在基础饲料中添加不同浓度的AFB(0、50、100、200和400 ppb),进行为期56 d的养殖试验。结果表明,高浓度的AFB(200和400 ppb)显著抑制了乌鳢的生长性能、饲料利用及免疫能力(P<0.05);200和400 ppb的AFB显著提高了血清中AST、ALT、ALP、LDH及AFB蓄积水平(P<0.05);并且,肝脏组织病理学和超微结构观察结果表明,AFB(100、200和400 ppb)破坏了肝组织结构,导致肝细胞空泡化及坏死,肝细胞内线粒体肿胀、空泡化及内质网肿胀。综上所述,AFB能够造成乌鳢肝脏损伤;且200 ppb的AFB是诱导肝损伤模型的最佳浓度,并进行转录组测序。肝脏转录组学分析结果显示,共鉴定出1307个DEGs,48条显著富集的信号通路;其中细胞色素P450的异种生物代谢、内质网中的蛋白加工、谷胱甘肽代谢和PI3K-Akt信号通路与饲料中AFB诱导的乌鳢肝损伤密切相关。(2)AFB通过CYP450s/ROS/ERS途径诱导乌鳢肝损伤在试验一的基础上,进一步验证了AFB诱导乌鳢肝损伤的作用机制。结果表明,饲料中AFB促进乌鳢肝脏I相代谢酶cyp1a、cyp1b及cyp3a表达(P<0.05);抑制了II相代谢酶GST的活性及基因表达水平;提高了乌鳢肝脏ROS、MDA及8-OHd G水平,降低了GSH-Px、SOD及CAT的酶活性及基因表达水平(P<0.05)。此外,AFB显著上调了乌鳢肝脏内质网应激相关基因(grp78、ire1及jnk等)及炎症基因(nf-κb、il-1β及il-8等)表达水平(P<0.05);同时,AFB显著提高了乌鳢肝脏TUNEL染色阳性细胞数量,并上调了促凋亡基因(cas-3、cyt-c及bax等)的表达水平(P<0.05),但抑制了bcl-2和iκbα的表达水平(P<0.05)。综上所述,饲料中AFB能够促进乌鳢肝脏I相代谢反应(CYP450s),抑制II相代谢反应,导致AFB的有毒代谢产物蓄积;此外,其I相代谢的副产物ROS能够导致肝脏氧化损伤,并激活ERS通路,进而诱导细胞凋亡和炎症反应,造成肝脏损伤。由此可见,AFB可通过CYP450s/ROS/ERS途径诱导乌鳢肝脏损伤。(3)α-LA对乌鳢生长性能、抗氧化能力及抗病力的影响本节试验为探究α-LA对乌鳢生长性能、抗氧化能力及抗病力的影响,在基础饲料中添加0、300、600、900、1200及1500 ppm的α-LA,进行为期56 d的养殖试验。结果表明,α-LA能够提高乌鳢FBW、WG、SGR及PER,并降低FCR(P<0.05);其还能够降低血清中AST和ALT活性(P<0.05);提高头肾、脾脏及肝脏中GST、GSH-Px和SOD等抗氧化酶活性及相关基因表达水平(gst、gsh-px、gr等)(P<0.05);此外,α-LA显著提高乌鳢的血清免疫指标(C3、C4、Ig M等)(P<0.05),促进il-10及tgf-β等抗炎基因的表达(P<0.05),提高乌鳢攻毒后的存活率,但抑制il-1β、il-8及tnf-α等促炎基因的表达(P<0.05);并且以上各指标分别在600或900 ppm组出现极值。综上所述,饲料中添加α-LA可有效提高乌鳢的生长性能、免疫力及抗氧化、抗炎和抗病能力,并保护肝脏健康;且乌鳢配合饲料中α-LA的最佳添加水平为600～900 ppm。(4)α-LA对AFB诱导乌鳢肝损伤的保护作用本试验在试验一、二及三的基础上,以基础饲料为对照组,并分别在200 ppb AFB饲料中添加0、600及900 ppm的α-LA,分别命名为CON、AFB、600α-LA及900α-LA,进行为期56 d的养

关键词： 粗棕榈油   黄曲霉毒素B1   赭曲霉毒素A   啶虫脒   苏丹染料   表面增强拉曼光谱学   纳米传感器   化学计量学   模式识别算法  

摘要： 粗棕榈油(CPO)作为一种用途广泛的食用热带植物油,以其独特的营养价值和低成本在食品加工、工业生产et al领域广受欢迎。然而,随着CPO市场的不断扩大,质量和安全问题引起了人们的极大关注,非法食品添加剂、农药残留和霉菌毒素污染et al问题给消费者带来了重大健康风险,故加强市场食品监督和检测对于解决这些健康问题至关重要。目前我国已经制定标准技术手段用于食品中危害成分的定性判别及定量检测。然而,这些常规检测技术依旧存在一些明显的局限性,包括仪器设备和试剂昂贵,操作复杂以及测试时间较长et al,因此亟需开发出高效便捷的方法。表面增强拉曼光谱分析技术(SERS)以其传感器多样性,超高灵敏度和独特的指纹特性et al原因被广泛成为理想替代方法应用于检测领域。本研究基于SERS结合化学计量学技术,构建高效、快速、经济、无损、灵敏、选择性和便携的检测方法,成功实现CPO中痕量危害物(食品添加剂、农药、霉菌)的检测。主要的研究内容如下:1.基于SERS结合化学计量学定性判别模型的CPO中染料掺假研究。针对传统的CPO中掺假的染料检测方法存在的检测时间长,设备维护费用贵et al问题,本章以苏丹红II和苏丹红IV染料为研究对象,基于SERS与化学计量学的结合成功开发出一种新渠道实现CPO中苏丹红染料掺假的快速准确检测。首先合成中空的金银纳米花作为增强基底,继而将其与不同浓度的(0.005 ppm–4 ppm)苏丹染料的CPO样品孵育,采集SERS光谱,基于主成分分析法分别辨别CPO中的苏丹红II和苏丹红IV,前三个主成分贡献率总和达到了99.88%和99.90%。此外,线性判别分析(LDA)和K最近邻(KNN)算法证明了CPO中苏丹II和IV染料的高检测率。本研究开发的Au@Ag SERS传感器对苏丹II和IV染料的检测线低至0.0028 ppm和0.0019 ppm。结果表明,本研究开发的具有快速、灵敏和低成本特性的SERS技术为CPO和其他食用油的品质检测提供了重要研究基础,并有望在未来广泛推广。2.基于SERS结合多变量分析模型的CPO中多种苏丹红含量检测掺假研究。针对CPO中多种染料掺假难以定性定量的问题,本章以四种苏丹红染料(I-IV)为研究对象,开展了基于SERS技术的CPO中多种染料同时定量检测研究。首先合成双金属金银核壳纳米花作为SERS增强基底,将合成的纳米基底分别与CPO中四种苏丹红染料(I-IV)混合,采集SERS光谱。采用偏最小二乘(PLS)、蚁群优化-PLS(ACO-PLS)模型和遗传算法-偏最小二乘(GA-PLS)模型分别构建SERS光谱与四种苏丹红染料浓度之间的定量关系模型。结果表明,对于苏丹I、II、III和IV,GA-PLS模型的校准系数(Rc)值分别为0.9844、0.9865、0.9884和0.9888。此外,苏丹I、II、III和IV的实际样品回收率分别为88.0-113.0%,92.0-103.0%,91.2-98.5%and 97.0-109.5%。结果表明,本研究开发的具有快速、灵敏和低成本特性的SERS技术为CPO和其他食用油的品质检测提供了重要研究基础,并有望在未来广泛推广。3.基于SERS结合化学计量学技术的CPO中农药残留检测研究。针对CPO中农药残留检测需求量大,检测速度要求高et al问题,本章以啶虫脒(ACE)农药为目标,开展基于SERS结合化学计量学技术的CPO中农药残留检测研究。本研究以银纳米作为增强基底,与不同浓度(5–100 ng/g)的ACE样本混合,采用三种不同的变量筛选方法以筛选出鲁棒性较强的预测模型:连续投影算法-偏最小二乘法(SPA-PLS)、随机跳蛙-偏最小二乘法(RF-PLS)和无信息变量消除-偏最小二乘法(UVE-PLS)构建SERS强度与ACE浓度的定量检测模型。结果表明,RF-PLS模型表现出最优的预测性能,Rc值为0.990,预测系数(Rp)值为0.989,RMSECV(交叉验证的均方根误差)值为4.74,RMSEP(预测的均方根误差)值为5.17。最后,基于加标回收实验,RF-PLS模型的回收率介于93.89%和108.32%之间,结果表明该方法可用于ACE残留的定量检测。4.基于表面增强拉曼散射技术(SERS)结合化学计量学的原油棕榈油(CPO)中霉菌毒素的检测研究:具体来说,该研究侧重于使用Qu ECh ERS(快速,简便,廉价,有效,耐用,安全)提取方法和SERS技术来构建定量预测模型,检测原油棕榈油(CPO)中的黄曲霉毒素B1(AFB1)。首先合成金纳米粒子(Au NPs)作为SERS信号基底,与萃取后不同浓度的加标样品共同孵育,在最优条件下采集SERS信号,基于信号强度与目标浓度建立自举软收缩-偏最小二乘(BOSS-PLS)预测模型。结果