关键词： 黄曲霉   黄曲霉毒素B1   高通量测序   根际及果壳微生物   群落组成  

摘要： 黄曲霉菌是一种腐生性病原菌,侵染范围非常广,通过土壤侵染花生,潜伏至采收后发病,在花生和玉米等农作物发生尤为严重。并且在侵染后可产生有毒的次级代谢产物黄曲霉毒素,黄曲霉菌侵染是导致花生黄曲霉毒素污染的主要元凶。黄曲霉毒素毒性大、致癌力强,对我国花生安全生产造成严重威胁。其中,花生荚壳是花生抵御黄曲霉菌侵染的第一道防线。然而,花生根际及果壳微生物群落组成与黄曲霉菌关系不明确。因此,本试验选择抗黄曲霉花生品种中花6号、天府18以及敏感品种鄂花6号,解析花生不同生育期(苗期、开花期、成熟期)抗性品种以及敏感品种根际及果壳微生物差异;采用qPCR技术解析抗、感品种间黄曲霉产毒菌关键基因丰度差异以及HPLC-MS/MS测定抗感品种间黄曲霉毒素含量差异。本试验主要结果如下:1、测定了苗期、开花期及成熟期花生根际及果壳微生物的α多样性、β多样性和微生物群落组成。发现微生物群落间的多样性和丰富度会因花生品种、花生生育期及花生采土部位等因素产生差异。α多样性结果表明,在成熟期抗性品种(天府18及中花6号)果壳中微生物Shannon指数显著高于鄂花6号;β多样性结果表明,PCOA发现苗期不同品种间根际微生物群落结构无显著性差异;花期中花6号与鄂花6号根际以及果壳周围微生物群落结构逐步分离;成熟期中花6号与鄂花6号根际以及果壳周围微生物群落结构显著分离。在花期和成熟期抗性品种中门水平中Acidobacteriota,Myxococcota,Gemmatimonadota 及 Planctomycetota 的相对丰度显著增加。进一步LEfSe分析发现,根际和果壳中抗性品种显著富集Pseudomonas,Pantoea,Lysobacter,Stenotrophomonas,Paenibacillus及Bacillus明显富集。抗性品种与敏感品种在花期和成熟期的微生物群落结构存在巨大差异,初步推测以上6种菌可通过一定的作用机制抵抗黄曲霉侵染及产毒。2、通过LEfSe分析从抗黄曲霉品种中筛选出6株优势菌株,并测定了 6种菌株在成熟期花生果壳和根际的相对丰度。发现Lysobacter在抗性品种中的相对丰度显著高于敏感品种,结合在花生成熟期果壳中抗感品种在黄曲霉菌产毒存在显著差异的结果,发现黄曲霉菌的产毒量会因Lysobacter的相对丰度变化而变化,成负相关关系。表明Lysobacter在抗性品种中富集,对侵染花生的黄曲霉菌存在抵抗作用。3、利用qPCR方法测定了成熟期花生中黄曲霉产毒关键基因F-omt基因的拷贝数,发现F-omt基因的拷贝数因采样部位和花生品种等因素而产生差异的结果。花生成熟期果壳中敏感品种鄂花6号中黄曲霉菌产毒关键基因F-omt基因拷贝数为抗性品种(中花6号和天府18)的1.45～1.70倍,花生成熟期果壳中敏感品种鄂花6号中黄曲霉菌产毒关键基因F-omt基因拷贝数为抗性品种(中花6号和天府18)的1.17～1.93倍。这些结果表明:黄曲霉菌产生黄曲霉毒素与花生抗性存在一定联系,推测花生自身产生特殊化学部分招募有益微生物抵抗黄曲霉菌的侵染及产毒。4、构建了花生果仁和果壳中黄曲霉毒素B1快速检测方法。在0.01～0.1 mg/kg范围内,果壳样品中黄曲霉毒素B1的平均回收率为73.41%～106.69%,相对标准偏差(RSD)为3.52%～8.71%;果仁样品中黄曲霉毒素B1的平均回收率为70.25%～89.65%,RSD为3.38%～5.56%。进一步样品检测发现,果仁和果壳样品中黄曲霉毒素B1均未检出。表明花生黄曲霉产毒量均很低。

关键词： 异辛醇   黄曲霉   黄曲霉毒素B1   生长抑制   抑制机理  

摘要： 黄曲霉(Aspergillus falvus,***)可污染多种粮油农作物,包括玉米、小麦和花生等,造成它们的食用和经济价值降低。此外,***产生的黄曲霉毒素B1(AFB1)被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物,严重威胁到人和动物的生命安全。在课题组前人的研究成果中,发现一株枯草芽孢杆菌所产挥发性有机物质中的异辛醇具有稻谷防霉效果,但其抑菌效果和机理尚不明确。本文首先揭示了异辛醇对***的抑菌效果,接着对其生长和产毒的抑制机制进行初步探究,最后就异辛醇在高水分含量的玉米、小麦和花生储藏防腐中的应用进行了研究。主要的结果如下:1.通过平板对扣法和96孔板梯度稀释法两种不同的作用方式探讨了异辛醇对***的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),接着研究了异辛醇对孢子萌发、菌丝体干重和菌落直径的影响。结果表明:异辛醇在熏蒸方式的平板对扣法和混入方式的96孔板梯度稀释法下对黄曲霉MIC分别为0.169μL/mL和6.25 μL/mL,这两种浓度下的异辛醇可以明显地降低孢子的萌发率、降低菌丝体干重和抑制菌落直径的再扩大。2.通过测定异辛醇对胞内物质泄露、电导率、麦角甾醇含量、细胞膜的完整性、活性氧含量、DNA损伤程度和AFB1的含量的影响,并结合SEM和TEM对细胞形态和微观结构进行观察,使用RT-qPCR技术分析了相关基因表达转录水平。结果表明:异辛醇处理后***的麦角甾醇含量降低,物质泄露严重,胞外电导率增加,细胞膜通透性增加,活性氧水平升高,DNA的损伤加剧,抑制AFBi含量的积累、麦角甾醇合成途径大部分相关基因、AFB1合成途径前期的调控基因aflD和全局调控因子LeaA、VeA和VelB基因进行表达下调,进而使得***生长和产毒受到阻碍。3.采用高水分含量的玉米、小麦和花生作为***的生长基质,在温度为28±2℃和湿度为75%的贮藏条件下,使用异辛醇熏蒸接种***后的玉米、小麦和花生,通过测定霉菌总数、脂肪酸值和AFB1含量,评价异辛醇熏蒸的防霉应用效果。结果表明:浓度0.169μL/mL的异辛醇就可以起到对玉米和小麦很好的防霉效果,同时异辛醇熏蒸可以显著抑制玉米、小麦和花生脂肪酸值的升高,有效降低AFB1的积累含量,从而可以延缓品质变劣的程度。

关键词： β-环糊精包合   粗粒化模拟   分子动力学模拟   经皮促透   力场开发   中药制剂  

摘要： 分子动力学模拟是一种基于牛顿力学原理的计算方法,可模拟分子的运动轨迹、能量变化、结构演化等,是研究分子或分子体系结构与性质的重要研究方法,已成为生物、化学、药物制剂等领域中的新型研究手段。其中粗粒化分子动力学模拟因简化了分子结构而极大提高了运算效率,能够研究更大尺度的生物分子过程。在中药制剂研究中涉及大量药物与药物、药物与辅料乃至与生物机体之间的相互作用,如药物的包载与释放、药物的经膜渗透等,受经典实验限制,难以在分子尺度深入阐释其内在机制,粗粒化分子动力学模拟为上述研究提供了有力的研究工具。在粗粒化分子动力学模拟中,力场用于描述分子间的相互作用和能量变化,决定了分子的动力学行为。因此,合理可靠的粗粒化力场是确保模拟结果准确性的前提。由于目前粗粒化模拟多用于蛋白质、高聚物等大分子的模拟研究,缺乏小分子粗粒化力场的构建方法,加之中药小分子结构复杂多样,多含环状甚至并环状,导致中药小分子粗粒化力场的缺乏,极大限制了粗粒化分子动力学模拟方法在中药研究领域的应用。因此,为完善中药化学成分粗粒化力场构建方法,推动粗粒化分子动力学模拟在中药研究中的应用,本文主要开展了以下三个方面的工作:(一)中药小分子粗粒化力场的构建及验证本部分基于苯丙素类、醌类、黄酮类、萜类四类典型中药母核结构,筛选出24种中药小分子构建粗粒化结构,根据全原子模拟结果,结合相关动力学模拟计算软件获取粗粒化力场参数,构建粗粒化力场。以键长、键角、二面角、溶剂可及表面积和回旋半径作为评价参数,评价粗粒化力场结构的合理性;以溶剂化自由能为评价参数,评价粗粒化力场热力学性质的合理性。结果表明,所构建的中药小分子粗粒化力场的结构和热力学性质验证结果良好,可直接为粗粒化分子动力学模拟研究提供相关中药小分子的力场参数,并为后续中药小分子粗粒化力场数据库的开发奠定基础;此外,基于力场开发过程提出适用于中药小分子的粗粒化力场构建原则,为其他中药小分子粗粒化力场的开发提供参考。(二)β-环糊精包合中药小分子的模拟研究本部分以增溶这一中药制剂中的重要环节作为应用场景,验证所建的中药小分子粗粒化力场在实际应用中的合理性。选择常用于β-环糊精包合以提高溶解度的单环苯丙素类药物阿魏酸和双环苯丙素类药物蛇床子素,使用粗粒化模拟方法模拟β-环糊精对药物的包合过程,同时采用宏观实验中最常用的饱和水溶液法制备β-环糊精包合物,分别计算模拟和实验所得β-环糊精的包合率,比较模拟层面和宏观实验层面β-环糊精对两种药物的包合效果,并借助粗粒化模拟方法在分子尺度研究β-环糊精对不同药物包合存在差异的机制。结果发现,两种药物在模拟和经典实验中包合效果的趋势保持一致;当药物体积较小、形态近似棒状且与β-环糊精具有较强相互作用时,更易与β-环糊精形成包合物。上述结果表明,所构建的粗粒化力场能够重现实验的结果,从而在实际应用场景中验证了所建力场的合理性与准确性;同时,探究了 β-环糊精包合药物的作用机制,为β-环糊精在制剂开发中的应用提供理论指导。在此基础上,结合经典实验引入包合率作为模拟评价参数,进一步完善了粗粒化模拟在β-环糊精包合研究中的评价参数体系,加强了模拟和宏观结果间的关联性,为相关应用提供方法指导。(三)中药小分子经皮促透模拟研究本部分以药物经皮促透作为应用场景,验证所建的中药小分子粗粒化力场在实际应用中的合理性。选择三种促透剂(柠檬烯、桉叶油醇、萜品醇)对亲脂性药物蛇床子素的经皮促透体系,通过考察不同促透剂加入前后药物在脂质膜中的分布情况,比较不同促透剂的促透能力和效果。结果表明,三种促透剂均可增加蛇床子素在脂质膜中的分布,且柠檬烯表现出了最好的促透效果。同时,在分子尺度研究三种促透剂对脂质膜和蛇床子素的影响,进一步挖掘促透剂的促透机制。结果发现,促透剂可通过降低脂质排列有序程度、提高脂质流动性、加剧药物扩散、增强OST与脂质膜之间的相互作用等发挥促透作用。上述结果表明,模拟结果能够重现经典实验的结果,表明所建力场合理可靠。同时,对三种促透剂促透机制的探讨,为中药化学成分经皮渗透的相关研究提供了数据支撑。在此基础上,结合经典实验引入渗透率作为模拟评价参数,进一步完善了粗粒化模拟在药物经膜促透研究中的评价参数体系,为相关应用提供了方法指导。综上所述,本文构建了一系列中药小分子的粗粒化力场,开发了一套适用于中药小分子的粗粒化力场参数化方法。在此基础上,选取部分中药小分子粗粒化力场,以实际中药药剂学应用场景为背景,开展效果及机制研究,进一步验证了本文所建粗粒化力场的合理性;同时,完善了模拟方法评价体系,为粗粒化模拟在中药研究中的应用提供方法参考。

关键词： 电化学生物传感器   催化发夹自组装   CHA-DNAzyme系统   黄曲霉毒素B1   aflR基因  

摘要： 随着我国中医药事业的不断地发展,中药疗效在国际市场得到认可、重视的同时,其安全性也受到广泛关注。中药材在种植、加工、运输和储藏环境中易受到多种真菌毒素污染,从而影响中药材的质量,其中,黄曲霉毒素B1被认为是毒性最强、致癌性的真菌毒素之一。因此开发快速、灵敏的中药中黄曲霉毒素B1的检测方法是当前中药质量控制中迫在眉睫的重要任务;同时研究中药中黄曲霉毒素B1生物合成的关键调控基因aflR基因的高灵敏检测方法,有望在黄曲霉毒素B1检出之前实现对合成黄曲霉毒素B1的前体物质基因(aflR基因)的高效灵敏检测,从而达到对黄曲霉毒素B1污染的预警作用,以控制和降低黄曲霉毒素B1对人们健康构成的威胁及减少经济损失。电化学生物传感器具有易于制造、信号产生简单、便于微型化和集成等特点,已广泛应用于现场高灵敏检测。在本文中,我们合成了新型信号标记物、金属有机框架材料,基于催化发夹自组装(CHA)、CHA介导的双端DNAzyem级联反馈策略构建了两种电化学生物传感器并成功用于黄曲霉毒素B1及调控基因aflR的检测,具体内容如下:(1)利用催化发夹自组装(CHA)的信号放大策略和全新的信号标记物四二茂铁,研制了一款无固定化的电化学适体传感器,并成功用于AFB1的检测。整个扩增过程发生在均相溶液中,在探针H2两端标记有四二茂铁,并含有大量未杂交的T碱基,这使得四二茂铁向电极表面靠近,产生了高效放大信号。在AFB1的诱导下,发生CHA反应生成了大量的H1-H2双链体和AFB1的循环利用。在最佳条件下,传感器峰值电流与AFB1浓度对数(0.1μM-1 pM)之间具有良好的线性相关性,通过三倍信噪比得到的检测限为0.255 pM。此外,所制备的传感器具有良好的选择性、重复性和稳定性,展示了灵敏稳定的AFB1检测方法。(2)采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取aflR基因,从霉变的陈皮上分离出疑似的菌丝接种于察氏培养基中,通过观察菌落颜色、形态以及显微镜鉴定,初步认定为黄曲霉霉菌,通过和黄曲霉菌标准菌株3.4408对照确定为黄曲霉菌。以上述菌株为试验菌株,通过PCR、紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳扩增和鉴定了与黄曲霉毒素B1产生相关的调控基因aflR基因,并送至测序公司测序,将测序结果与基因库进行比对,结果表明同源性可达到99.21%,将确定提取得到的aflR基因4℃保存,为后续aflR基因的检测提供良好的样品。(3)为了更好的预判黄曲霉毒素是否存在污染,我们选择检测与黄曲霉毒素生物合成相关的aflR基因。将DNAzyme生物催化剂和催化发夹组装(CHA)反应集成在一起,构建了一款基于CHA-DNAzyme策略的电化学DNA传感器并用于aflR基因的灵敏检测。为了简化检测步骤,我们合成了Mg@UiO-66(Zr)-(COOH)MOFs。在这里,探针H3末端标记有氧化还原报告分子四二茂铁。将无活性的DNAzyme亚基部分分别设计在这些亚稳态的CHA发夹反应物中,这些反应物在动力学上受到阻碍,没有发生相互杂交。aflR基因催化CHA介导的哑铃状双端DNAzyme结构自主连续杂交,使得DNAzyme进一步循环切割探针H3,由于大量四二茂铁离开电极表面,电化学信号显著降低。结果表明,传感器在0.512 pM-0.2μM的良好线性范围内,检测限低至0.9079 fM(S/N=3),并且传感器对不同的错配DNA和不同时间多次检测具有高特异性和稳定性,以及评估了所提出电化学DNA传感器在实际提取基因检测中具有的潜在应用能力。

关键词： 肝微粒体   黄曲霉毒素B1   圆弧偶氮酸   代谢转化   电化学生物反应器  

摘要： 近年来,因真菌毒素污染而导致的食品安全问题层出不穷,对人类的身体健康产生了巨大威胁。圆弧偶氮酸(Cyclopiazonic acid,CPA)作为一种新兴的真菌毒素,因其与毒性极强的黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)存在共暴露途径,而被关注和研究。有报道指出,它们共同作用会对人体肝脏产生协同毒性。因此,有必要对AFB与CPA在肝脏内的毒理学机制进行系统研究,其中探究AFB与CPA在肝脏内的代谢转化过程是明确两者毒理学机制的重要部分。目前,研究真菌毒素在肝脏内代谢转化机制的模型主要包括动物模型和细胞模型,两种模型各有优势,也有其自身不足。肝微粒体作为一种体外肝脏代谢模型,相比于其它模型,表现出操作简单、试验周期短等优势。因此,本论文构建并优化了多种肝微粒体模型,以AFB为研究对象,探究了它们用于研究真菌毒素代谢转化机制的可靠性及优势;之后,将它们用于新兴毒素CPA的代谢转化和毒理学机制研究。最后,基于肝微粒体模型需要外界提供电子发生代谢反应这一机理,将肝微粒体与电化学相结合,探究构建了可用于AFB和CPA代谢检测的电化学生物反应器。主要研究内容包括:1.构建肝微粒体模型并将其应用于真菌毒素AFB的代谢研究。选用人、大鼠、小鼠和鸡肝微粒体,通过优化代谢孵育时间、肝微粒体孵育用量等条件,构建了4种不同种属的肝微粒体模型。以AFB为研究对象,从代谢产物、代谢途径及代谢种属差异三个方面研究了所构建肝微粒体模型的可靠性及优势。结果表明,AFB经4种肝微粒体模型分别代谢后,共产生了6种代谢产物,分别为还原产物M-1(CHO)、脱氢产物M-2(CHO)、羟基化产物M-3(CHO)、羟基化产物M-4(CHO)、羟基化产物M-5(CHO)和葡萄糖醛酸结合产物M-6(CHO),其中产物M-2和M-6推测为AFB的新型代谢产物。此外,还发现大鼠肝微粒体对AFB的代谢能力最强,小鼠肝微粒体对AFB的代谢能力较弱。综上所述,肝微粒体模型较好模拟了人和动物肝脏的生理环境,实现了AFB的多途径代谢,同时其操作简单、实验周期短,可用作后续真菌毒素的代谢转化研究。2.基于上述构建的4种肝微粒体模型,探究了新兴毒素CPA在人和动物体肝脏内的代谢转化过程。结果表明,CPA经4种肝微粒体模型分别孵育后,共产生了4种代谢产物,分别为脱氢产物C-1(CHNO)、羟基化产物C-2(CHNO)、甲基化产物C-3(CHNO)和葡萄糖醛酸结合产物C-4(CHNO)。种属代谢差异分析显示,大鼠肝微粒体对CPA的代谢能力最强,其次为人肝微粒体,小鼠和鸡肝微粒体的代谢能力最弱。在此基础上,选取了人肝微粒体中7种主要细胞色素P450酶(CYP450),进一步探究了新兴毒素CPA在人肝微粒体中的具体代谢酶型。结果显示,不同酶型产生的代谢产物存在显著差异。脱氢产物C-1只在CYP3A4酶的孵育体系中检测到。羟基化产物C-2和甲基化产物C-3在CYP3A4、1A2、2D6、2E1、2A6和2C19孵育体系中均有检出,其中以CYP3A4酶的代谢能力最强。因此,综合思考推测,CYP3A4酶是人肝微粒体中代谢CPA的主要酶型。3.基于人肝微粒体探究构建“Cocktail”探针药物法,用于新兴毒素CPA的毒理学机制研究。本章节从代谢相互影响的角度出发,探究了CPA对人肝微粒体中四种主要CYP450酶(CYP3A4、1A2、2D6、2A6)活性的影响。首先构建了可用于评价CYP450酶活性的“Cocktail”探针药物法,通过专属性、精密度等多种方法,证实了所构建探针药物法的准确、可靠性。之后基于构建的探针药物法探究了CPA对四种CYP450酶活性的影响。结果表明,CPA对人肝微粒体中CYP3A4酶具有中等抑制作用(IC值为8.658μM),对CYP2D6、CYP1A2和CYP2A6酶不具有抑制作用。由于CYP3A4酶是人肝脏中的主要代谢酶型之一,CPA对CYP3A4酶活性的中等抑制作用可能会导致肝脏的代谢紊乱,这可能是CPA的重要毒性靶点之一。4.探究构建肝微粒体电化学生物反应器,用于真菌毒素AFB和CPA的代谢检测。本章节基于肝微粒体模型需要外界提供电子发生代谢反应这一机理,将肝微粒体与电化学相结合。首先探究合成了Au@MXene纳米复合材料,并用其吸附大鼠肝微粒体(RLM)构建了肝微粒体电化学生物反应器。电极在负电位下为肝微粒体模型提供代谢所需电子。结果表明,肝微粒体与电极之间实现了良好的电子传递且Au@MXene纳米复合材料显著提高了电化学生物反应器的催化性能。所构建的肝微粒体电化学生物反应器在安培电流法(I-t)下,成功将真菌毒素AFB和CPA分别催化为它们的羟基化产物。基于这一代谢途径,我们建立起催化电流与底物浓度的比例关系,实现了对底物的代谢检测。AFB在0.01μM～50μM

关键词： 介质阻挡等离子体   黄曲霉毒素B1   阿月浑子   降解产物   营养品质  

摘要： 阿月浑子是木本油料树种之一种豆科植物。其果核富含油脂、蛋白质、矿物质、多种维生素及生物活性成分,具有一定的保健和药用价值。然而坚果的种仁含有脂肪54.6%～60%,潮湿的环境和不当的储存条件导致阿月浑子易感染黄曲霉毒素B,造成品质损失同时给人类带来食用安全隐患。这使选择高效降解方法、探究降解机制及降解后营养品质变化是我国坚果研究过程中亟待研究与解决的问题。阿月浑子坚果仁作为原料,通过单因素试验和响应面试验优化等离子体降解阿月浑子中的黄曲霉毒素B。介质阻挡等离子体在放电功率200 W,放电时间5 s和放电间距0.4 cm的条件下降解乙腈中的黄曲霉毒素B,运用高效液相色谱-质谱联用仪和电喷雾-傅里叶变换-离子回旋共振质谱进行分析。通过液质数据和高分辨质谱验证进行初步的分子量分析,再以Masshunter匹配和双键等价值进行推导,并结合已报道的等离子体机理,分析出5种降解产物的分子式及结构式,再对可能的降解产物进行轰击获得二级质谱碎片,依据质谱裂解规律再次匹配,加以确证5种降解产物的结构式并命名,从而精准分析其降解途径。为研究等离子体降解阿月浑子中AFB后对营养物质是否有影响,检测阿月浑子降解前后的理化性质和脂肪酸组成、扫描电镜和观察内部结构、贮藏稳定性实验观察处理效果的维持时间。研究结果如下:1.阿月浑子坚果仁为原料,通过单因素试验和响应面试验优化等离子体降解阿月浑子中的黄曲霉毒素B,AFB的最大理论降解率为98.5%,实测值为93.4%,确定了该条件为最佳工艺条件。2.通过分析得到的分子结构和再次确认的二级质谱数据密切匹配,并阐明了五个降解产物结构和三个降解途径。在降解率为35.8%的情况下,根据5种降解产物毒性位点损失的情况,推测介质阻挡等离子体处理之后产物毒性与降解率一致。3.研究发现等离子体处理后对理化性质无显著变化,扫描电镜发现内部结构变饱满,贮藏稳定性实验发现处理后品质可保持两周,脂肪酸比例更接近推荐值。可得出等离子体处理对阿月浑子不仅有降毒效果,还能起到保鲜作用。

关键词： 腐植酸   文献计量学   非水电导滴定   黄曲霉毒素B1   生物膜  

摘要： 腐植酸(Humic acids,HAs)是一类富含酚羟基与羧基等活性基团的高分子化合物,具有极好的修复肠道损伤和治疗肠道疾病的功能。遗憾的是,HAs的作用机制尚不清楚。本文从HAs分子结构和性质出发,通过以下工作探究其作用机制:(1)采用文献计量学法,对HAs领域的文献进行系统评价。对1980-2020年发表的9145篇文献的特征进行深入分析后发现,与HAs相关的文献发表数量增长迅速,中国发表数量最多(3109篇),其次是美国(1949篇)和德国(679篇)。具体而言,中国科学院的文献数量最多(647篇),是最具生产力的机构,同时也是机构合作网络的中心。与HAs相关的研究主要集中在环境领域,HAs在处理重金属和有机污染物方面的应用及其机理是环境领域的重要研究课题。HAs可以降低多种有机污染物的毒性,或通过光降解和吸附作用消除污染物,分子中的羧基和酚羟基是其发挥作用的关键基团。此外,HAs还可用于处理重金属污染物。HAs对重金属具有吸附作用,从而降低了重金属在环境中的迁移率和毒性。另外,HAs在传统医学领域被用作止泻药物;在养殖业被用作饲料添加剂促进畜禽生长速率和健康;在农业中,HAs可以通过改善土壤和提高肥料利用率来提高作物生长和质量;还可用于碳固存以适应气候变化。然而,文献计量分析表明HAs的分子结构仍然不清楚,从而限制了机制的阐明和进一步的应用。这些发现强调了HAs与环境之间的相互作用,并提供了关键的见解,这不仅支持HAs在环境领域应用中的进一步开发,也为HAs在其他领域中的研究和应用提供新的思路。(2)目前定量测定HAs分子中酸性基团的方法或操作复杂,或检测难度高,或测量结果不准确。因此该部分建立了一种可快速、准确测定HAs中酚羟基和羧基含量的方法——非水电导滴定法(NACT)。通过优化HAs样品的p H值、滴定液浓度和氮气流速,确定了最佳滴定条件为:样品p H值为4,滴定剂浓度为0.05mol/L,氮气流速为80 m L/min。NACT测定的对羟基苯甲酸的酚羟基含量为758.82±111.76 cmol/kg,羧基含量为744.44±51.11 cmol/kg。对羟基苯甲酸中酚羟基和羧基的理论含量均为723.96 cmol/kg,表明该方法可以准确定量对羟基苯甲酸中的羧基和酚羟基。使用NACT测定的HAs标准品中酚羟基和羧基含量与传统方法(醋酸钙法)测定结果无显著差异,这表明NACT可快速、准确地测定HAs中酚羟基和羧基的含量。此外,利用NACT对全国8个省/自治区的29个HAs样品进行了酸性基团的含量测定,选择酸性基团含量最高的一种HAs进行后续试验。(3)黄曲霉毒素B1(AFB1)是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次级代谢产物,是目前公认的毒性最强的天然有机污染物,具有极强致癌性,广泛存在于食品中。通过上述研究我们得知,HAs具有吸附有机污染物的潜力,分子中的羧基和酚羟基是其发挥作用的关键基团。因此,该部分工作选择酸性基团含量较高的S6号HAs样品,并就其对AFB1攻毒小鼠的作用效果进行了深入研究。结果显示,HAs减轻了AFB1诱导的肝细胞肿胀和炎性细胞浸润。HAs还恢复了受AFB1干扰的肝脏中各种酶的水平。HAs通过增强小鼠的免疫功能,显著减轻AFB1引起的氧化应激和炎症反应。HAs通过增加小肠长度和绒毛高度来修复被AFB1损害的肠道屏障功能。此外,HAs重建了肠道微生物组,增加了Desulfovibrio、Odoribacter和Alistipes的相对丰度。体外和体内试验都表明HAs可以通过吸附作用有效地去除AFB1。综上,HAs可以通过增强肠道屏障功能、调节肠道微生物群和吸附作用来减轻AFB1诱导的肝损伤。(4)肠道微生物组与炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)高度相关。从Web of Science Core Collection数据库中共提取了2000-2020年与这两个术语相关的3890篇文献,从文献计量学角度对关联性进行了研究。自2008年以来,与该领域相关的文献数量迅速增加。美国和哈佛大学分别是发表文献数量最多的国家和机构。《Inflammatory Bowel Diseases》是最多产的期刊,共刊发了211篇文献。该领域最有影响力的期刊是《Gut》,引用次数为13359次。共被引分析显示,IBD相关主题中关注度最高的是“gut microbiota”、“metagenomics”、“bacterial community”、“fecal microbiota transplantation”、“probiotics”和“colitis-associated colorectal cancer”。关键词聚类和关键词突发分析显示,肠道菌群、宏基因组学和粪便菌群移

关键词： 黄曲霉毒素B1   纳米抗体   免疫磁珠   抗原模拟表位   免疫层析  

摘要： 黄曲霉毒素B(Aflatoxins B,AFB)是曲霉属真菌产生的一种有毒次级代谢产物,具有很强的致癌性和肝毒性,常见于被污染的玉米、花生及大米中,会造成严重的经济损失并威胁食品安全,因此建立一种快速、灵敏、准确的检测方法是十分必要的。在真菌毒素的免疫分析检测中一般以传统的单克隆抗体和化学合成抗原作为元件,但单克隆抗体的制备过程复杂且成本较高,化学合成抗原的制备存在价格昂贵、危害操作人员健康等限制因素。而纳米抗体以其制备简单、性质稳定、生产成本低等优点,在真菌毒素的免疫检测逐渐显现出独特优势。本研究以抗AFB纳米抗体为元件,制备了抗AFB纳米抗体免疫磁珠,并将其应用于AFB免疫层析试纸条中,另外,为获得能与抗AFB纳米抗体配对使用的检测抗原模拟物,为AFB无毒绿色免疫分析方法的建立提供基础,本研究还开展了以AFB纳米抗体为配体,投入噬菌体随机展示十二肽亲和淘选AFB抗原模拟表位的探索研究,取得的主要研究结果如下:1)原核表达抗AFB纳米抗体,间接竞争ELISA测得其与AFB单克隆抗体的IC分别为4.17 ng/m L、0.36 ng/m L,之后以该纳米抗体为研究对象,分别采取MNPs@Nb、MNPs@SA@Nb、MNPs@Catcher@Nb三种方法制备抗AFB纳米抗体免疫磁珠,通过ELISA、测定Zeta电位以及BCA蛋白定量的方法对偶联效果进行表征,结果表明,MNPs@Nb、MNPs@SA@Nb、MNPs@Catcher@Nb三种免疫磁珠均成功制备,偶联量分别为22.00mg/mg、27.76mg/mg、24.15mg/mg。2)以前期制备的MNPs@Nb、MNPs@Catcher@Nb、MNPs@SA@Nb为新型信号探针,建立基于抗AFB纳米抗体的免疫层析试纸条检测方法。最优条件下,MNPs@Nb、MNPs@Catcher@Nb、MNPs@SA@Nb的试纸条肉眼判读检测AFB的灵敏度分别为4.0、4.0、6.0 ng/m L,与传统的AFB胶体金试纸条比较,灵敏度提高一倍。基于MNPs@Nb、MNPs@Catcher@Nb、MNPs@SA@Nb探针所建立免疫层析试纸竞争抑制曲线,其IC分别为0.25 ng/m L、0.16 ng/m L、0.45ng/m L。特异性实验表明,所构建的三种免疫层析试纸条与其他真菌毒素(DON、ZEN、OTA、FB)均无交叉。在花生油提取液中添加AFB标准品进行加标回收实验,加标回收率为81～121.3%,变异系数为9.3～14.2%,表明三种试纸条均具有较好的准确性和精密度。3)以抗AFB纳米抗体为靶分子,分别采取基于MNPs@Nb的液相淘选和基于Spy Tag-Catcher自组装的固相淘选两种方法从噬菌体展示十二肽库中筛选AFB抗原模拟表位,两种方法的阳性率分别为3.1%和30.9%,测序后发现-LSFQYHKVPQGG-、-STLLLSGAVDIW-两个序列得到富集,但并未获得AFB的抗原模拟表位。

关键词： 免疫层析法   快速检测   改良上转换纳米粒子   玉米赤霉烯酮   黄曲霉毒素B1  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是毒性最大、致癌性最强的真菌毒素,被世界卫生组织癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物,会诱使人和动物发生严重的肝损伤,甚至导致肝癌和死亡。玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种具有雌激素活性、污染范围广的真菌毒素,可对人和动物表现出强烈的生殖毒性。AFB1和ZEN主要存在于农作物及其制品中,二者的混合污染可导致显著的协同效应和增效效应,使毒性大幅增加。免疫层析技术（Immunochromatographic assay,ICA）因具有检测快速,生产成本低,操作简单,结果直观等优点,被广泛地应用于单种或多种真菌毒素的现场定量检测。本研究通过掺杂镧系稀土离子制备两种改良的上转换纳米粒子（Up-conversion nanoparticles,UCNPs）,并将其作为标记物构建检测ZEN的免疫层析试纸条。比较两种UCNPs-ICA的检测灵敏度,选择Lu-UCNPs作为标记物构建双重检测试纸条,以实现对谷物样品中AFB1和ZEN的同时检测。主要研究结果如下:1、基于La掺杂UCNPs的免疫层析法快速检测ZEN本研究采用热分解法合成La掺杂的UCNPs,优化其离子掺杂比例,并应用于免疫层析检测ZEN。结果表明,20%La掺杂的UCNPs具有最佳的形态结构和荧光性能,将其记为La-UCNPs。经聚丙烯酸（Polyacrylic acid,PAA）对La-UCNPs表面进行羧基修饰后,将其与ZEN单克隆抗体偶联制备免疫探针,建立一种新型的谷物中ZEN荧光免疫层析检测方法。优化PAA用量、抗体标记量、检测时间和荧光免疫探针浓度,确定最佳条件分别为2.0 m L、20μg、10 min和8 mg/m L。在最佳检测条件下,La-UCNPs-ICA对ZEN标准品溶液的检出限（Limit of detection,LOD）为0.25 ng/m L,变异系数（Coefficient of variation,CV）小于8.67%,线性相关系数R=0.9944。此外,特异性试验结果表明,制备的试纸条对ZEN具有高度特异性。该方法对小麦和玉米中ZEN的LOD均为0.5μg/kg,加标回收率分别为87.65%～99.26%和84.12%～95.12%,对应的CV为1.289%～7.143%和4.033%～9.013%。与胶体金试纸条和高效液相色谱（High-performance liquid chromatography,HPLC）相比,La-UCNPs-ICA具有更好的灵敏度和基质耐受性,且三种方法在天然谷物样品检测中表现出高度的一致性。2、基于Lu掺杂UCNPs的免疫层析法快速检测ZEN采用热分解法合成了不同Lu掺杂比例的UCNPs,通过扫描电镜、X射线衍射仪、能量色散光谱、傅里叶红外光谱和荧光光谱仪对其进行表征。结果发现,30%Lu掺杂的UCNPs表现出最佳的粒子特性和荧光性能,将其记为Lu-UCNPs并作为标记物用于后续试纸条的开发。对试纸条检测条件进行优化,确定最佳抗体标记量、T线抗原浓度、荧光探针浓度和样品稀释液分别为10μg、0.8 mg/m L、10 mg/m L和PBST稀释液。最佳检测条件下,Lu-UCNPs-ICA对ZEN标准品溶液的LOD为0.1 ng/m L,在0～100 ng/m L范围内具有良好的线性关系（R=0.9946）,且与其他真菌毒素无交叉反应。该方法对玉米和小麦中ZEN的LOD均为0.16μg/kg,加标回收率分别为82.11～100.76%和79.64～98.51%。此外,Lu-UCNPs-ICA、胶体金试纸条和HPLC对天然谷物样品的检测结果一致。因此,这种新型Lu-UCNPs-ICA可用于定量监测谷物样品中ZEN的痕量残留。3、基于改良UCNPs免疫层析竞争法同时检测AFB1和ZEN的应用研究通过比较La-UCNPs和Lu-UCNPs的荧光性能及其构建的免疫层析方法检测灵敏度,确定效果更优的Lu-UCNPs作为后续试纸条的标记物,并将其记为IUCNPs（Improved UCNPs）。基于IUCNPs构建检测AFB1的单通道检测条带,优化后的抗体标记量和荧光探针浓度分别为20μg和8 mg/m L,其对ZEN标准品溶液的LOD为0.1 ng/m L。在优化的单通道检测条件基础上,进一步构建一种基于IUCNPs的新型双重检测试纸条,可在10 min内实现对AFB1和ZEN的同时检测,其LOD分别为0.025和0.1 ng/m L,校准曲线的R分别为0.9931和0.9982。将试纸条于室温下储存在避光干燥环境中保存2个月,条带T1/C和T2/C值的平均相对强度分别为98.24%和99.65%。此外,试纸条检测阴性和阳性样品的批内和批间变异系数均小于10%。