关键词： 荧光   表面增强拉曼光谱   双信号适配体传感器   磁性纳米颗粒   黄曲霉毒素B1  

摘要： 黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）是分布最广、毒性最强、危害最大的一种真菌毒素,主要分布在谷物、坚果及其加工产品中,潮湿环境下由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生,其热稳定性非常好,难以破坏,使用烹调方法和常规热加工方法都不易使其分解。AFB1在粮食及其加工产物中的污染可导致肝细胞癌和食道癌等。目前,大多数AFB1的检测方法通常基于单个信号,虽然检测方便,较为灵敏,但是容易受到共存物质、各种仪器和非标准分析程序的干扰。因此,不少研究采用了双信号的检测方式,通过使用两种替代仪器在各种实验条件下进行灵活检测,并将这两个信号结合起来进行相互验证和补充,提高了检测性能。表面增强拉曼光谱（Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS）作为一种超灵敏和快速检测技术,具有独特的分子结构指纹,能够显著放大拉曼信号,实现目标物的超灵敏检测,但由于基底分散不均匀,有时其再现性和稳定性也相对较差。另一方面,荧光检测具有信号易于读取、再现性和稳定性良好等优点。二者的优势和劣势刚好互补。因而,SERS-荧光双信号传感器可以提高检测的可靠性和准确性,拓宽检测范围,更好地相互验证彼此之间的检测结果。本文基于银包磁性纳米颗粒（Ag coated magnetic nanoparticles,MNP@Ag）构建了两种SERS-荧光双信号适配体传感器用来检测AFB1,论文主要研究内容如下:（1）通过乙二醇/一缩二乙二醇双热溶剂法制备出均匀且分散性良好的MNP,在修饰一层带正电的聚乙烯亚胺（PEI）后,在其表面组装上带负电的金纳米颗粒（Au NPs）;以Au NPs作为种子位点,通过银氨反应在其周围形成一层完整连续的Ag壳,从而合成了MNP@Ag。Ag壳的形貌大小对SERS强度有着显著影响,通过添加不同量的硝酸银,从而优化出最佳SERS性能的MNP@Ag。当硝酸银的添加量为25 mg时,MNP@Ag拥有最佳的SERS增强性能,且此时MNP@Ag分散性良好,大小均匀,平均粒径大小为131.56 nm,并且所制备的MNP@Ag具有超顺磁性,可以有效避免粒子间的聚集,因而在磁铁作用下能够快速从反应体系中分离。（2）基于MNP@Ag-PEI与适配体修饰的荧光染料cy5（apt-cy5）的SERS-荧光双信号适配体传感器检测AFB1,对于SERS方法,SERS强度(1467 cm处)与AFB1标准溶液的对数浓度之间线性方程为y=-1038.15x+3416.54,计算出的检测限（limit of detection,LOD）和定量限（limit of quantitation,LOQ）为0.45和1.499 pg/m L。对于荧光方法,在668 nm处的荧光强度与AFB1标准溶液对数浓度之间的线性回归方程为y=1083.83x+1128.24,LOD和LOQ分别分别为0.135和0.450 ng/m L。同时也通过实验证明其良好的特异性、重现性和稳定性。最后,该双信号适配体传感器对实际样品进行AFB1加标检测,结果与常用的酶联免疫法（ELISA）相比较,最终结果表明,SERS法、荧光法与ELISA方法测定的回收率分别为90.8%-110.4%、92.6%-111.6%和84.7%-105.7%,表明该双信号适配体传感器检测实际样品中的AFB1时具有一定的应用潜力。（3）基于适配体修饰的MNP@Ag（MNP@Ag-apt-cy3）与互补链DNA修饰的氮掺杂碳点（NCDs-c DNA）的SERS-荧光双信号传感器检测AFB1。在最佳的检测条件下,得到的SERS强度(1392 cm处)与AFB1标准溶液的对数浓度之间的线性回归方程为y=1084.66x+5000.53,LOD和LOQ分别为0.88和2.93 pg/m L;同时,相对荧光强度与AFB1标准溶液对数浓度之间的线性回归方程为y=808.01x+1660.93,LOD为9.74pg/m L,LOQ为32.43 pg/m L。同时通过实验证明该双信号适配体传感器具有优异的特异性、重现性和稳定性。最后该双信号适配体传感器对实际样品进行AFB1加标检测,并与常用的酶联免疫法（ELISA）相比较,SERS法与荧光法都得到了良好的回收率,展现出了较大的应用潜力。

关键词： 赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   适配体   DNA纳米结构   荧光分析方法   纸基分析方法  

摘要： 在我国传统饮食文化中,人们的主要食物是粮谷类食品,它们容易受到真菌毒素的污染。其中,赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B(AFB)都是毒性较强且常见的食品污染物,对人类和动物健康有严重威胁。因此,建立能够快速、准确检测OTA及AFB的分析方法具有重要的现实意义。本课题基于可特异性识别靶标的核酸适配体、荧光共振能量转移(FRET)作用、DNA纳米结构设计和磁分离技术,利用荧光和纸基分析方法,构建了简单、灵敏度高、特异性强的DNA荧光传感器,用于OTA及AFB的检测研究。具体研究内容如下:1.基于适配体的特异性识别作用和FAM与BHQ1之间FRET作用,构建了用于简单、快速检测食品中OTA的均相荧光传感器。利用NUPACK软件模拟了OTA适配体与其互补DNA的结合情况,并通过实验研究了OTA和互补DNA对OTA适配体的竞争结合情况。依据软件模拟和实验结果,选择最佳互补DNA为c DNA1-BHQ1。对影响传感器性能的其他实验条件进行优化,选择最优结合方式为OTA适配体与OTA先孵育30 min再加入c DNA1-BHQ1孵育30 min、最优孵育时间为60 min、最佳c DNA与Apt用量比为1:1、最优反应体系的p H值为7.4。在最优检测条件下,传感器检测OTA的线性范围为0.5-100 ng/m L,检出限(LOD)为0.13 ng/m L。该传感器用于检测玉米粉和葡萄酒样品中的OTA,平均回收率分别为100.0%-102.0%和98.0%-102.2%。纸基传感器制备工艺简单、便于携带、易于小型化。为了达到方便、快速检测OTA的目的,在制备的均相荧光传感器基础上,使用纸张作为传感器基底,构建了简单、低成本、易于长期保存的纸基荧光传感器用于检测食品中的OTA。在最佳检测条件下,传感器检测OTA的线性范围为10-2000 ng/m L,LOD为1.2 ng/m L。该传感器成功用于检测米粉和绿豆粉样品中的OTA,其平均回收率分别为89.2%-111.0%和89.0%-103.0%。2.设计了简单的“二维”DNA纳米结构,构建了X型DNA荧光传感器,利用快速磁分离技术,实现对AFB的高效检测。X型DNA纳米结构由DNA1、DNA2和四条FAM-Apt组成。其中DNA1和DNA2构成了X型DNA纳米结构的骨架部分,四条FAM-Apt分别部分互补在该结构的两端。将X型DNA荧光传感器与常规型DNA双链荧光传感器进行比较,发现X型DNA荧光传感器能够实现信号放大,节约磁珠用量降低检测成本,降低LOD,提高AFB的检测范围。通过优化实验参数,确定了最佳磁珠(MBs)用量为1.5μL,AFB最佳孵育时间为40 min。在最佳检测条件下,传感器检测AFB的线性范围为0.05-100 ng/m L,LOD为0.009 ng/m L。对红茶和玉米粉样品进行了加标检测,AFB的平均回收率为92.6%-107.3%和92.1%-104.4%。3.本章设计了稳定的“二维”DNA纳米结构,构建了音叉型DNA(TF-DNA)荧光传感器,利用快速磁分离技术,实现对OTA和AFB的同时检测。其中DNA1和DNA2构成了TF-DNA纳米结构的骨架部分,FAM-Apt和ROX-Apt分别部分互补在该结构的两端。对实验条件进行优化,确定了最佳MBs用量为3μL,最佳DNA1为DNA1-51,最佳DNA2为DNA2-45,毒素的最佳孵育时间为60 min。在最佳检测条件下,所制备的TF-DNA荧光传感器,检测OTA的浓度范围为0.05-100 ng/m L,LOD为0.015 ng/m L;检测AFB的浓度范围为0.1-100 ng/m L,LOD为0.045 ng/m L。该传感器对OTA和AFB均具有高度特异性。对红茶和小麦粉样品进行加标测试,OTA和AFB的平均回收率分别为94.1%-106.7%和92.8%-110.6%。

关键词： 医疗机构中药制剂   医疗机构制剂   DEMATEL-ISM模型   发展影响因素  

摘要： 医疗机构中药制剂是我国临床用药重要组成部分,也是我国中药新药研发的一条重要路径。安徽省作为中医药资源大省,中医药历史悠久,近年来鼓励医疗机构中药制剂发展。因此本文全面了解安徽省医疗机构中药制剂基本现状,深入挖掘制约制剂发展的影响因素及存在主要问题,并基于调研结果提出相应解决方案。本研究基于安徽省医疗机构中药制剂发展现状,分别从制剂研发、注册、配制、使用、监管五个阶段,对影响因素进行全面有效识别,构建影响因素集并验证,最终确立了19个影响因素指标体系。用决策实验室法(DEMATEL)来构建影响因素间的关系,识别出重要影响因素,在DEMATEL的基础之上引入解释结构模型(ISM)分析各层级影响因素之间的影响关系,并提出改进措施。通过影响因素识别出2个根源层影响因素,14个中间层影响因素,3个表象层影响因素,其中监管责任、监管能力为根源层关键影响因素,医院对制剂研发工作的重视程度、制剂研发的积极性、制剂注册政策要求、监管力度为中间层关键影响因素。根据各层级关键影响因素,提出安徽省医疗机构中药制剂可持续性发展路径,即强化协同联动,明确监管责任;多措并举,提高监管能力;拓展开发模式,增强重视程度;搭建研发平台,促进多方积极合作;结合实际情况,优化配套政策规定;健全配套制度,加大监管力度等措施。

关键词： 表面增强拉曼光谱   局域表面等离子共振   密度泛函理论   时域有限差分   黄曲霉毒素B1  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是真菌代谢产生的一种霉菌毒素,具有高危害性。AFB1会导致大量农产品污染,给人类生产生活造成巨大损失。常规检测AFB1方法需要昂贵仪器、检测时间长和专业人员操作等,所以,迫切需要研究出简单便捷、高灵敏、高效检测方法。表面增强拉曼散射光谱(SERS)和局域表面等离子共振光谱(LSPR)两者都基于等离子体共振效应的光学技术,以SERS和LSPR为基础构建的光学生物传感器具有快速、高灵敏度和特异性强特点,在生命科学、环境监测、农业和食品安全等领域广泛应用。基于此,本论文通过构建SERS和LSPR光学生物传感器对AFB1进行快速检测,主要研究内容有:(1)采用密度泛函理论计算AFB1拉曼特征峰,确定拉曼位移1586 cm为AFB1拉曼特征峰。根据分子前沿轨道理论和静电势,AFB1分子最小极值点在分子中O(20)、O(25)原子中间,因此,银纳米团簇易与AFB1分子选择此位置进行配位。通过Ag纳米颗粒基底与AFB1的SERS实验结果和理论计算结果对比分析,证实两者之间的一致性。(2)采用时域有限差分对Au@AgNPs结构进行仿真分析。首先仿真分析了Au@AgNPs间隙与其电场增强之间的关系,在波长532 nm光源激发下,计算不同粒子间隙的电场强度。结果表明,目标物与Au@AgNPs颗粒间距越小,产生电场强度越强。其次,仿真计算不同厚度银壳结构电场分布,在波长532 nm光源激发下,调节不同厚度银壳,观察电场分布情况。结果显示,随着银壳厚度由1 nm增加到5.2 nm,Au@AgNPs颗粒的电场强度大幅提高,但是当银壳厚度从5.2 nm增加到8.5 nm时,由于Au@AgNPs结构的性能受到金核和银壳之间配对效应影响,银壳过厚减弱了和金核之间的电子配对效应,所以Au@AgNPs颗粒的电场强度增加缓慢。(3)基于Au@AgNPs良好的稳定性和较高的SERS增强性能。本研究采用Au@AgNPs基底对AFB1进行定量检测实验。通过合成不同尺寸Au@AgNPs,结合紫外-可见分光光谱和FDTD仿真结果,选择采用32 nm金核和5.2 nm银壳的核壳结构为SERS基底,对AFB1进行检测,线性相关系数R=0.9798,回收率95.67%～97.25%,检测限为0.83 ng·m L。(4)利用金纳米颗粒光学局域表面等离子共振机理,构建了一种金纳米颗粒探针LSPR光学生物传感器。金纳米颗粒表面附着带负电柠檬酸根离子,后加入带负电适配体,适配体通过金硫键包裹在金纳米颗粒上,颗粒间因静电斥力而均匀分散,当加入Na Cl和不同浓度AFB1时,适配体与AFB1特异性结合后从金纳米颗粒表面脱落,使金纳米颗粒在Na Cl的作用下发生团聚现象,导致其LSPR光谱发生对应的变化,从而实现对AFB1快速、高灵敏度、特异性强的检测,线性相关系数R=0.9884,回收率92%～97.69%,检测限为36 ng·m L。

关键词： 包合技术   β-环糊精   包合物  

摘要： 本文从包合物的定义、常见的包合材料、以及包合物的制备方法三个方面对包合技术进行了系统的介绍。其次，本文总结了包合技术在中药领域中的应用，包括：掩盖药物的不良气味；增加药物的稳定性；增加药物的溶解度；调节药物的释药速度；提高药物的生物利用度。

关键词： 姜黄素   黄曲霉毒素B1   斑马鱼   肝损伤   损伤机制  

摘要： 黄曲霉毒素是危害性最大的一类霉菌毒素,而黄曲霉毒素B又是黄曲霉毒素中毒性最强的一种,严重危害食品和饲料安全,威胁人和动物的生命健康。黄曲霉毒素B其作用的主要靶器官为肝脏,其在机体的代谢过程中可通过引起肝脏氧化损伤,诱导肝细胞凋亡等,从而导致肝脏发生损伤。姜黄素被证明具有抗氧、抗氧化、降脂等多种药理作用,已有报道被用于修复一些毒性损伤,而目前对于利用姜黄素修复AFB诱导的肝损伤的作用机制研究较少。因此本文利用斑马鱼幼鱼构建了AFB诱导的肝损伤模型,以探究姜黄素对其造成的肝损伤作用的修复机制。从而为今后利用姜黄素修复肝损伤的药物靶向治疗提供科学依据。主要研究内容及结果如下:首先通过斑马鱼幼鱼的表型、肝脏荧光面积及强度、ALT、AST酶活测定和油红染色结果确定了AFB的肝损伤作用和姜黄素具有修复作用,并通过用50μg/L AFB对3 hpf的斑马鱼胚胎暴露至48 h后构建斑马鱼幼鱼的肝损伤模型,然后用不同浓度的姜黄素进行修复至144 h,发现其会改善因AFB暴露引起的肝脏变小的情况及降低ALT、AST酶活并改善脂肪的蓄积情况,在500μg/L姜黄素修复时,修复效果最好。其次通过靶向代谢组学、脂质组学的手段,探究了姜黄素和AFB对斑马鱼幼鱼内源性代谢物的影响。结果发现AFB对斑马鱼幼鱼体内的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸等氨基酸代谢产生影响,这些氨基酸主要影响斑马鱼幼鱼体内的氧化应激、炎症反应,并引起机体的免疫反应、细胞凋亡,能量代谢等相关生物过程;还会参与PC类甘油磷脂代谢从而引起肝脏损伤及卵黄囊处脂质积累造成肝脏损伤。而姜黄素损伤修复多与谷胱甘肽的代谢、PC类甘油磷脂代谢相关,参与体内的抗氧化过程、能量代谢相关,说明姜黄素可能通过参与抗氧化以及脂质代谢相关通路来参与到脂肪细胞的分化当中,从而减轻AFB所造成的肝脏损伤作用。最后利用转录组学的技术手段对靶向代谢组学和脂质组学的结果进行了再次验证。通过转录组学KEGG通路分析发现其会参与精氨酸的生物合成并使得花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸等脂质代谢异常,这与代谢组与脂质组中的结果一致。而在转录组中还发现了串联花生四烯酸代谢通路的关键基因pla2g1b,其有可能是AFB引起肝脏损伤并且姜黄素起到修复作用的关键基因。除此以外还发现cpa5、ctrl、cel.2、mapk12、il21等和炎症及凋亡有关基因,这也许是姜黄素发挥药理作用从而起到修复肝损伤作用的重要因子。综上所述,结合表型结果,并运用代谢组学、脂质组学和转录组学的多组学联合技术,确认姜黄素可改善因AFB暴露引起的斑马鱼幼鱼肝损伤,并可能通过影响对斑马鱼幼鱼体内的关键基因pla2g1b从而引起花生四烯酸、亚麻酸、亚油酸等脂质代谢和精氨酸的氨基酸代谢来起到修复作用。

关键词： 赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   双特异性抗体   量子点微球   免疫层析方法  

摘要： 真菌毒素是丝状真菌在适当条件下产生的有毒次级代谢产物,对人和动物的健康构成巨大威胁。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种由曲霉和青霉产生的次级代谢产物,具有肝毒性、免疫毒性和致癌性,被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类致癌物。黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)是一种由寄生曲霉和黄曲霉产生的次级代谢产物,是黄曲霉毒素中毒性和致癌性最强的物质,被IARC列为1类致癌物。OTA和AFB作为两种剧毒的真菌毒素,广泛存在于黄豆、玉米和大米等农作物中。更重要的是,OTA和AFB会共存于一种农作物中,通过协同效应导致毒性增强。因此,亟需建立一种可以同时检测农作物中OTA和AFB的方法。本研究制备了抗OTA和AFB的双特异性单克隆抗体(Bispecific monoclonal antibody,BsMAb),建立了量子点微球(Quantum dot beads,QBs)免疫层析方法(Lateral flow immunoassay,LFIA),用于黄豆、玉米和大米中OTA和AFB的同时检测。主要研究方法和结论如下:(1)分别利用8-氮鸟嘌呤和5-溴脱氧尿嘧啶核苷诱导OTA和AFB杂交瘤细胞,得到次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型OTA杂交瘤细胞和胸苷激酶缺陷型AFB杂交瘤细胞。采用杂交-杂交瘤技术将其进行融合,经4次亚克隆后获得了4株(2E7、2F7、4B2和3G9)能特异性识别OTA和AFB的BsMAb细胞株。通过间接竞争酶联免疫吸附法评价BsMAb的性能,OTA的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC)分别为0.65、0.58、0.60和0.67ng/m L;AFB的IC分别为0.29、0.22、0.25和0.26 ng/m L;且特异性良好。选择灵敏度最高的BsMAb-2F7进行抗体亚型鉴定,结果表明BsMAb为Ig G1型。(2)基于传统的抗OTA单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)和抗AFBmAb,分别建立了QBs-LFIA用于检测黄豆、玉米和大米中的OTA和AFB。对mAb偶联的p H、EDC用量、mAb标记量、OTA-BSA浓度、AFB-BSA浓度和QBs-mAb探针添加量进行了优化。在最优条件下,基于传统抗OTA mAb的QBs-LFIA检测黄豆、玉米和大米中OTA的IC分别为3.21、2.73和1.47μg/kg,加标回收率为87.21%-132.49%,变异系数为0.51%-12.79%;基于传统抗AFB mAb的QBs-LFIA检测黄豆、玉米和大米中AFB的IC分别为0.05、0.07和0.09μg/kg,加标回收率为80.38%-132.38%,变异系数为2.39%-11.63%。两种方法的检出限均满足我国国标对黄豆、玉米和大米中OTA和AFB的限量要求。(3)OTA和AFB可能同时存在于一种农作物中,为了提高检测效率,本研究基于制备得到的可特异性识别OTA和AFB的BsMAb,建立了一种快速高效的QBs-LFIA用于黄豆、玉米和大米中OTA和AFB的同时检测。对BsMAb偶联的p H、EDC用量、BsMAb标记量、OTA-BSA浓度、AFB-BSA浓度和QBs-BsMAb探针添加量进行了优化。在最佳条件下,对基于BsMAb的QBs-LFIA进行性能评价,分析本方法的灵敏度和特异性,结果表明基于BsMAb的QBs-LFIA检测黄豆中OTA和AFB的IC分别为0.73μg/kg和0.01μg/kg,玉米中OTA和AFB的IC分别为1.14μg/kg和0.03μg/kg,大米中OTA和AFB的IC分别为1.69μg/kg和0.07μg/kg;且特异性较好。加速保存实验的结果表明本方法较稳定。通过加标回收实验分析本方法的准确性,黄豆、玉米和大米样本的加标回收率为80.20%-130.05%,且变异系数为1.09%-10.41%。因此,本方法具有较好的灵敏度、特异性、稳定性和准确性,适用于黄豆、玉米和大米中OTA和AFB的筛查。综上所述,本研究制备了可同时识别OTA和AFB的BsMAb,基于这种新型的BsMAb,建立了可以同时检测农作物(黄豆、玉米和大米)中OTA和AFB的QBs-LFIA,为OTA和AFB的高效定量检测提供了有力的技术支撑。

关键词： 芩连秦皮汤   犬细菌性腹泻   Toll样受体4(TLR4)   核因子κB(NF-κB)  

摘要： 犬细菌性腹泻作为犬类(Canis lupus familiaris)常见的由病原菌引起的腹泻性疾病，临床常使用抗生素治疗，增加了耐药菌出现的几率。芩连秦皮汤在幼儿细菌性腹泻治疗中具有良好的疗效，本研究拟明确芩连秦皮汤在犬细菌性腹泻中的治疗效果。首先使用半仿生酶提取法提取芩连秦皮汤有效成分，以打孔法检测提取物的体外抑菌效果，利用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)检测中药提取物的细胞毒性；进一步以大肠杆菌(Escherichia coli)感染犬肠上皮细胞，利用q RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测提取物对Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)、核因子κB (nuclear factorκB, NF-κB)、白细胞介素1β(interleukin 1β, IL1β)、IL6、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、B淋巴细胞瘤-2 (B cell lymphoma-2, Bcl2)和Bcl2相关蛋白X (Bcl2-associated X, Bax)基因及蛋白水平的影响，使用TUNEL法检测细胞凋亡；最后，使用观察法明确提取物对犬细菌性腹泻的临床治疗效果。体外实验结果显示，中药提取物能够有效抑制大肠杆菌生长，在一定浓度范围和作用时间内无细胞毒性；在大肠杆菌感染的犬肠上皮细胞中，中药提取物能够显著抑制TLR4、NF-κB、IL1β和IL6基因表达，降低TLR4蛋白表达和NF-κB磷酸化水平，减少IL1β和IL6分泌水平；同时降低PCNA蛋白表达和Bcl2/Bax水平，降低细胞凋亡率。在体实验结果显示，中药提取物对犬细菌性腹泻有效，虽然单独治疗的时间长于头孢曲松钠，但是其与头孢曲松钠的中西药联合治疗使止泻时间明显缩短。上述结果提示，中药提取物可能通过抑制炎性因子的表达和分泌来抑制大肠杆菌引发的炎性反应和细胞凋亡，从而发挥对犬细菌性腹泻的治疗作用，并减少临床治疗过程中的抗生素使用。本研究为芩连秦皮汤在犬细菌性腹泻临床治疗中的应用提供基础资料。

关键词： 纳米抗体   免疫层析试纸条   黄曲霉毒素B1   金纳米花   生物素-链霉亲和素   磁珠  

摘要： 黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物,分布广,毒性强,危害极大,严重威胁人类和动物健康,被世界卫生组织列为I类致癌物。因此,建立一种高效、灵敏和实现现场检测的方法用于AFB检测对保障人类健康具有重要意义。免疫层析试纸条(Immunochromatographic test strips,ICTS)是一种简单、快速的检测方法,其操作简便、检测快速、特异性强、稳定性好且携带方便,已广泛应用于食品安全、临床诊断、环境监测等领域。然而,传统免疫层析试纸条大多数以单克隆抗体为识别元件,由于其制备过程复杂、无法大批量生产、价格昂贵等缺点,限制试纸条的开发与应用。纳米抗体(Nanobody,Nb)来源于骆驼血清中存在的仅重链抗体,是目前体积最小的基因工程抗体,可通过原核表达进行大批量生产,稳定性强,易于表达形成具有多功能的融合蛋白。近年来,其已被广泛应用于食品安全检测领域。本研究以纳米抗体作为识别元件,以不同粒径金纳米花(Gold Nanoflowers,Au NFs)和磁珠(Magnetic Bead,MB)作为信号标签,利用纳米抗体的高特异性和稳定性与纳米材料良好的光学特性、较大的比表面积和超顺磁性,构建了高效、灵敏的免疫层析试纸条检测方法,实现对食品中AFB的快速和现场实时检测。具体研究内容如下:1.本实验将对AFB具有高特异性与敏感性的纳米抗体G8(Nb-G8)与抗地高辛抗体融合构建重组载体p ET25b-G8-DIG,将其转化至*** BL21中并进行表达,最终得到分子量约为30 KDa的纳米抗体G8-DIG,通过间接竞争酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)对蛋白活性进行测定。将G8-DIG作为识别元件,既能特异性识别AFB,又能特异性识别地高辛抗原(Digoxin,DIG),利用地高辛抗原替代传统纳米抗体免疫试纸条所用的Anti-His-m Ab二抗,提高试纸条稳定性且节约成本。制备粒径为110 nm的Au NFs,通过静电吸附与纳米抗体G8-DIG偶联制备信号探针,构建基于金纳米花纳米抗体免疫层析试纸条检测AFB。对Au NFs与G8-DIG偶联最佳p H、G8-DIG最佳添加量、最佳检测时间与温度、甲醇耐受性、最佳喷金量、AFB-BSA浓度和DIG-BSA浓度进行优化,并在最佳实验条件下建立标准曲线。该方法检测AFB的线性范围(IC～IC)为1.02～27.86 ng/m L,最低检测限(Limits of Detection,LOD)为0.1 ng/m L,加标回收率在91%～100%之间。此外,该纳米抗体免疫层析试纸条具有良好的分析性能,成功应用于标准玉米质控样品的分析,为实际样品中AFB的检测提供了方法。2.为提高信号标签的光学特性进一步提升试纸条检测灵敏度,本研究基于纳米抗体和生物素-链霉亲和素系统构建了双探针信号放大免疫层析试纸条检测AFB。首先,利用化学法对Nb-G8进行生物素化,优化Nb-G8与生物素最佳摩尔比为1:20。其次,制备两种粒径的Au NFs,粒径为65 nm的Au NFs与G8-Bio偶联作为信号探针,粒径为110 nm的Au NFs与链霉亲和素(Streptavidin,SA)偶联作为信号放大探针,分别喷涂在金标垫和扩大垫上,利用生物素-链霉亲和素之间的高亲和力进行信号放大,并与未信号放大生物素化纳米抗体ICTS进行比较。实验结果表明,在最佳实验条件下,未进行信号放大生物素化纳米抗体ICTS的检测范围为0.76 ng/m L～85.26 ng/m L,LOD为0.12 ng/m L,而双探针信号放大ICTS的检测范围为0.2 ng/m L～119.4 ng/m L,LOD为0.03 ng/m L,试纸条灵敏度提高了4倍,且具有更宽的检测范围。最后,对玉米实际样品进行加标回收实验,加标回收率在100%～102%之间。3.为进一步提高信号探针的稳定性和实现利用纳米抗体免疫层析试纸条对具有较深颜色实际样品中AFB高灵敏检测,本实验利用生物素链霉亲和素相互作用,将生物素化的纳米抗体G8与链霉亲和素磁珠(Magnetic beads Streptavidin,MB-SA)进行偶联制备信号探针。MB-SA具有较高光学特性和超顺磁性,即使在复杂的样品机制下,MB-SA-G8-Bio也对AFB表现出显著的结合、分离和富集能力。在最佳检测条件下,该方法的LOD为0.063 ng/m L,检测范围为0.36 ng/m L～39.74 ng/m L。并将该基于磁分离技术纳米抗体免疫层析试纸条应用于酱油中AFB的检测,其IC为0.069 ng/m L,与标准测试基本相同。该方法为深色实际样品中AFB的检测提供了

关键词： 仓储稻谷   黄曲霉   黄曲霉毒素B1   ISSR分子标记   生物防治  

摘要： 稻谷是我国重要的储备粮食,尤其在我国南方,稻谷是人们的第一主食,然而由于南方地区高温和高湿的气候条件,稻谷很容易受到黄曲霉的侵染并产生黄曲霉毒素,对人们的健康构成威胁。因此本文对中国南方仓储稻谷中黄曲霉的流行特征进行研究,探讨其在不同生态环境下的分布规律和产毒特征;分析黄曲霉分离株的生物多样性,评估多样性对黄曲霉产毒能力的影响;以不产毒黄曲霉作为生物防控手段系统探究了其对产毒黄曲霉的抑制效果。主要研究结果如下:1.对采自我国南方稻谷主产区(江苏、浙江、湖南、湖北、安徽、江西、福建)的315份稻谷样品中的菌株进行了分离纯化,基于形态学特征以及Ca M测序,共鉴定出81株黄曲霉分离株,黄曲霉分离株主要来自湖南省和江西省,江苏省和浙江省黄曲霉分离株分布较少。通过超高效液相色谱法(HPLC-FLD)对黄曲霉分离株产毒力的分析,其中有56株黄曲霉分离株被检测到可产生黄曲霉毒素B(AFB)。产毒黄曲霉分离株和不产毒黄曲霉分离株在7个省份的分布差异较大,随着7个采样省份平均温度的降低,产毒黄曲霉菌株的百分比逐渐增加。地理区域以及温湿度的差异影响黄曲霉分离株的分布和产毒能力。2.通过对黄曲霉分离株菌核大小的测定发现S型(菌核直径<400μm)黄曲霉分离株AFB产量较高,而L型(菌核直径>400μm)黄曲霉分离株中AFB产量低或者不产AFB。PCR方法鉴定AFB生物合成关键基因,结果表明所有产毒黄曲霉分离株都存在afl R基因,而不产毒黄曲霉分离株在AFB生物合成基因簇的区域存在关键基因的缺失。同时利用ISSR分子标记对黄曲霉分离株的遗传多样性进行了研究,81株黄曲霉分离株基因型之间存在显著的遗传差异,遗传相似系数为0.53～1.00,当遗传相似系数为0.61时,黄曲霉分离株可以分成7个主要聚类。使用来自同一粮库的产毒黄曲霉分离株和不产毒黄曲霉分离株进行共培养试验,结果表明在粮库储存环境中,不产毒黄曲霉分离株的存在能够降低储藏过程中的AFB污染风险。3.对不产毒黄曲霉对对产毒黄曲霉的抑制规律进行了研究,实验结果表明不产毒黄曲霉通过抑制产毒黄曲霉的产孢量和菌落的径向生长来抑制黄曲霉毒素产量。在单株不产毒黄曲霉与产毒黄曲霉体外共培养实验中,当以1:50的孢子浓度比例延迟1天接种不产毒黄曲霉时,抑制产毒效果达到了最佳。而在混合不产毒黄曲霉与混合产毒黄曲霉共培养实验中,当以1:2的孢子浓度比例同时接种混合不产毒黄曲霉与混合产毒黄曲霉时,抑制产毒效果达到了最佳。以稻谷和花生为培养基质进行原位培养试验,不产毒黄曲霉对产毒黄曲霉的生长以及产毒量均表现出抑制效果。结果表明,当少量不产毒黄曲霉存在时,即可对产毒黄曲霉产生较好的生物防控效果,本研究为防治黄曲霉毒素的污染提供理论依据。