关键词： 黄曲霉毒素B1   Burkholderia sp.D6   降解机理   转录组   固态发酵  

摘要： 黄曲霉毒素B(AFB)是一种次级代谢产物,具有高度的肝毒性、肾毒性和免疫毒性。AFB以其毒性、致癌和致畸突变作用而闻名,被世界卫生组织归类为I类致癌物。花生是最容易被黄曲霉毒素浸染的作物之一,花生脱脂后的副产物花生粕富含花生蛋白,但因毒素含量超标使其在饲料和食品领域的应用受限。因此AFB的脱除成为研究的热点。目前AFB的脱除方法主要分为物理、化学和生物脱毒法,生物脱毒法因具有效率高、能耗低、绿色环保等优点,受到人们的青睐。因此本研究选用生物法脱除AFB,采用香豆素为唯一碳源,以AFB降解率为指标,从不同原料中筛选出AFB高效降解菌株Burkholderia sp.D6,并对其降解AFB的产物结构和毒性进行表征,探究Burkholderia sp.D6对AFB的降解机制;结合转录组技术对优势菌株Burkholderia sp.D6中的黄曲霉毒素降解酶及其相关基因进行挖掘,并揭示其对AFB的代谢途径;最后将Burkholderia sp.D6应用于花生粕中AFB的降解,生产饲用发酵花生粕并分析花生粕品质。主要研究结果如下:选取土壤、花生、花生粕和羊粪等原料为筛菌来源,进行富集培养,经过初筛和复筛后挑选出高效降解AFB的菌株,并对发酵条件进行优化。经以香豆素为唯一碳源的摇瓶培养和平板初筛,获得90株生长状态良好的细菌。加入AFB标准溶液进行复筛后得到16株可有效脱除AFB的菌株,筛选AFB降解率(66.93%)最高的D6为优势菌株,经菌株鉴定确定D6为伯克霍尔德属(Burkholderia),并对Burkholderia sp.D6的生长曲线进行测定,结果表明Burkholderia sp.D6在LB培养基孵育18 h后进入对数生长期。以AFB脱除率为指标,通过正交优化实验得到Burkholderia sp.D6脱除黄曲霉毒素B的最佳条件为:发酵时间为84 h,发酵温度为37℃,接种量为10%,初始p H为7.0,在此条件下AFB脱除率为(87.91±2.32)%。选用不同方式处理发酵液组分,确定D6对AFB的生物脱除方式,通过UPLC-MS/MS和NMR表征AFB的降解产物,并通过MTT法检测降解产物的细胞毒性。以细菌发酵液、发酵液的上清液和菌体悬浮液分别降解AFB,发酵液和上清液的效果分别为87.91%和89.12%,无显著性差异(P>0.05)。上清液的降解率远高于菌悬液,表明Burkholderia sp.D6脱除AFB的方式为生物降解。使用UPLC-MS/MS、HNMR、COSY等检测方法,鉴定出三种AFB的降解产物分别为P1:CHO;P2:CHO;P3:CHNO,并推测出其结构式。使用Hep G2检测降解产物的细胞毒性,发现降解产物共培养的细胞状态优于AFB共培养的细胞,表明降解产物的细胞毒性与AFB相比显著降低。采用转录组学技术对Burkholderia sp.D6中黄曲霉毒素降解酶基因及差异表达基因进行剖析。以不加AFB的样品为对照,研究Burkholderia sp.D6降解AFB过程中转录组的差异表达情况。结果表明,检测到的总基因数目为3541个,与对照相比,D6菌株显著差异基因有116个,其中显著上调差异基因51个,显著下调差异基因65个。GO富集分析发现,在生物过程中上调表达最多的基因主要涉及单有机体过程、代谢过程、细胞过程和本地化。细胞组分中上调基因主要集中在细胞、细胞部分、膜、膜部分、以及大分子复合物。分子功能中上调基因主要与催化活性、结合和运输活性有关。KEGG富集分析和Pathway代谢通路分析发现,Burkholderia sp.D6中存在大量AFB降解过程直接相关的酶类,如氧化还原酶、脱氢酶、过氧化氢酶和双加氧酶等,以及一些可能与AFB降解相关的酶的编码基因。此外还发现参与蛋白输出和细菌分泌系统的sec D、sec E、sec F、sec G、sec Y、yaj C和yid C等基因表达上调了1-3倍,cat、pca、paa等与芳香化合物代谢相关的基因显著上调。因此,推测Burkholderia sp.D6降解AFB的整个过程可能为:Burkholderia sp.D6受到AFB的刺激,AFB降解相关酶(氧化还原酶、过氧化氢酶等)上调表达,AFB在胞外被分解P1、P2、P3等产物。随后产物在双加氧酶和酯酶的作用下裂解为邻苯二酚、香草醛和苯甲酸等小分子芳香化合物,并被膜蛋白转运至细胞内部转化为乙酰辅酶A或草酰乙酸,最终进入TCA循环,为机体代谢利用。对Burkholderia sp.D6发酵花生粕的条件进行优化,并对发酵花生粕的品质进行分析。研究Burkholderia sp.D6固态发酵花生粕过程中,发酵时间、温度、菌株接种量和料液比等对花生粕中的AFB降解率的影响,通过响应面优化实验对Burkh

关键词： 黄曲霉毒素B1   免疫层析方法   金纳米粒子   量子点荧光微球   聚集诱导发光微球  

摘要： 霉菌是丝状真菌的总称,常见的霉菌包括曲霉菌(Aspergillus)、镰刀菌(Fusarium)、青霉菌(Penicillium)和交链孢霉(Alternaria),在合适的生存条件下,霉菌会侵染各种食品,导致其产生腐败和品质劣变。真菌毒素是真菌的代谢产物,当摄入或通过皮肤吸收真菌毒素时,会导致人类或畜禽生病或死亡,因此被认为是最具危险性的食品污染物之一。真菌毒素的污染会严重危害到我国的食品安全,并且制约我国的食品对外贸易。黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的代谢物,被认为是致癌性最强的一类化合物,在目前已经发现的AFs中,黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)的毒性最大,致癌性最强,且在自然界中分布广泛。发酵食品主要采用霉菌、酵母菌和细菌等多种微生物发酵而得到。常见的发酵食品包括发酵豆制品(豆酱、酱油等)以及谷物发酵品(食醋、白酒和黄酒等),能够产生AFB的黄曲霉菌和寄生曲霉菌在多种豆类、谷物及发酵食品中都有发现。发酵食品在制作、储存和运输过程中有可能被AFB污染。因此,有必要建立快速、灵敏、准确的方法用于发酵食品中AFB的检测。基于免疫学原理,本研究建立了三种免疫层析方法用于快速检测AFB。分别是以传统的胶体金纳米粒子(Gold nanoparticles,Au NPs)为信号标记材料的双T线免疫层析方法,用于AFB的定性检测;以新型的量子点微球(Quantum dot nanobeads,QBs)为信号标记材料的免疫层析方法,用于常见发酵食品中AFB的定量检测;以最新的聚集诱导发光微球(Aggregation-induced emission fluorescent microsphere,AIEFM)为信号标记材料的免疫层析方法,尝试用于常见发酵食品中AFB的定量检测。主要研究方法和结论如下:(1)基于免疫学原理建立了一种胶体金免疫层析方法(Gold nanoparticles-Lateral flow immunoassay,Au NPs-LFIA),该方法采用两条检测线的读取模式,可用于AFB的定性检测。通过柠檬酸钠还原法合成了Au NPs,对偶联单克隆抗体(Monoclonal antibody,m Ab)的p H、m Ab标记量、检测线上AFB-BSA的浓度、Au NPs-m Ab探针添加量、免疫反应时间进行了优化,建立了双T线Au NPs-LFIA,并对本方法的灵敏度进行了评价。在最佳条件下双T线Au NPs-LFIA检测AFB时,检测限分别为0.125 ng/m L和0.5 ng/m L。双T线Au NPs-LFIA可作为初步的快速筛查手段用于AFB的检测,能够区分出实际发酵食品中的弱阳性样本(国家最低限量标准)和强阳性样本,从而降低检测的假阳性率。(2)为了能够快速定量检测发酵食品中的AFB,本方法基于QBs建立了一种荧光定量免疫层析方法,对偶联m Ab的p H、EDC用量、m Ab标记用量、检测线上AFB-BSA的浓度、QBs-m Ab探针添加量和免疫反应时间进行了优化。在最优条件下,本方法在缓冲液中的标准曲线的线性方程为y=-1.9303 lg(x)–0.7847(R=0.994),IC为0.044 ng/m L,线性范围在0.01-0.2 ng/m L;在基质混合液中标准曲线的线性方程为y=-2.0374 lg(x)–0.7519(R=0.994),IC为0.0487μg/kg,线性范围在0.01-0.2μg/kg。通过选取10种发酵食品进行加标回收实验,加标浓度均为5μg/kg,加标回收实验的结果显示,加标回收率为74.53%-117.73%,变异系数(Coefficient of variation,CV)为1.55%-9.54%,10种加标食品样本的回收率平均值为102.59%,因此本研究建立的QBs-LFIA方法适用于多种发酵食品中AFB的定量测定。并且,特异性实验结果表明,本方法对于其他5种真菌毒素的交叉反应率均较低,加速保存实验结果显示,本方法的检测结果比较稳定。因此,本研究所建立的QBs-LFIA方法的灵敏度高、特异性好、检测结果的准确性和稳定性均能满足实际应用需求,有很好的应用前景。(3)以QBs为信号标记材料的LFIA方法已经较为成熟,本研究尝试将最新的具有优异光学性能的AIEFM材料应用于AFB的快速检测,这可以为AIEFM的实际应用奠定基础。本方法分别对偶联m Ab的p H、EDC用量、m Ab标记用量、检测线上AFB-BSA的浓度、AIEFM-m Ab探针的添加量和免疫反应时间等条件进行了优化。在最佳条件下,建立了定量标准曲线,其中,在缓冲液中的标准曲线的线性方程为y=-1.5255 lg(x)–0.4503(R=0.986),IC为

关键词： 食物过敏   黄曲霉毒素B1   Balb/c小鼠   肠道菌群   KU812细胞  

摘要： 随着社会发展和生产力水平的提高,但是食品的生物性安全问题仍时有发生,每年造成巨大的经济损失并存在极大健康隐患。人们通过摄食受污染的植物性食物(谷物)或动物性食物(肉、奶和蛋)摄入真菌毒素,而对人体健康带来危害。食物过敏是一些特殊人群暴露于某些含有过敏原的食物后所免疫系统的异常反应,其发生率也在逐年上升,严重影响患者的健康与生活质量。鸡蛋、牛奶及花生等食物含有主要的食物过敏原,同时也容易被真菌毒素污染,2种食品安全风险因子都具有免疫毒性,也在这些食物上具有重合性。因此,食品真菌毒素污染对食物过敏发生的影响值得进一步研究,有助于进一步科学评估食物过敏的风险因素。本论文分别从整体动物模型和体外细胞实验研究黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)暴露对卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏小鼠主要免疫指标的影响。根据致敏小鼠血清中特异性抗体、肥大细胞蛋白酶、脾细胞分泌细胞因子及空肠中食物过敏相关基因表达等多个理化指标,评估AFB暴露对OVA致敏小鼠产生的影响;并通过对小鼠肠道切片影响的观察及其肠道内容物菌群的分析,评估AFB暴露对OVA致敏小鼠的肠道黏膜免疫及肠道菌群的影响。通过构建OVA激发KU812细胞脱颗粒模型,评估AFB暴露对OVA激发KU812细胞脱颗粒的影响,进一步从细胞水平阐述AFB暴露对食物过敏的影响。论文研究主要方法、内容和结果如下:(1)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测OVA致敏小鼠血清中特异性抗体Ig E、Ig G、Ig G1及Ig G2a的含量及其肥大细胞蛋白酶的水平;采用ELISA商用试剂盒检测OVA致敏小鼠脾脏上清液中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平;采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测相关基因表达;流式细胞术检测Th1/Th2/Treg细胞的数量。结果表明,OVA致敏小鼠血清中特异性Ig E、m MCP-1水平及Th2细胞产生的细胞因子(IL-4、IL-5及IL-13)水平显著升高,OVA致敏模型构建成功。低剂量AFB使OVA致敏小鼠的特异性Ig E水平、IL-4及IL-13水平显著提升,分别提升68%、41%及75%;中剂量AFB使OVA致敏小鼠的m MCP-1和IL-13的水平显著提升;中剂量AFB使OVA致敏小鼠的m MCP-1和IL-5的水平显著提升,分别提高107%和22%;持续高剂量AFB对各项过敏指标没有显著改变。在4组AFB暴露的致敏小鼠体内,与Th1相关细胞因子(IFN-γ)的水平均有所下降,但无统计学意义。这些结果也Q-PCR和流式细胞分析得到进一步验证。(2)通过HE染色法对OVA致敏及其AFB暴露的BALB/c小鼠空肠组织空肠进行病理分析,并利用Illumina Mi Seq高通量测序平台对不同实验组小鼠盲肠内容物中的细菌16S r RNA V3—V4区的扩增子进行PCR扩增,然后采用生物信息学手段分析AFB暴露对OVA致敏小鼠的肠道菌群的结构、多样性及差异物种的影响。结果表明,OVA会导致小鼠肠道绒毛断裂以及肠腺体间距明显增宽;高剂量和持续高剂量AFB暴露对OVA致敏小鼠肠道屏障造成的损伤更严重。OTUs聚类分析(物种累积曲线、RANK分析、花瓣图)结果显示,各组小鼠的OTUs数目范围为514～521,OTUs数目共有率为94.6%,AFB对小鼠肠道菌群OTUs数目和均匀度影响较小。Alpha多样性分析表明,AFB暴露并未对小鼠肠道菌群的多样性和丰富度产生较大影响。Beta多样性分析表明,AFB使OVA致敏小鼠肠道菌群的结构发生重大变化,OVA组与中/高剂量AFB暴露组小鼠肠道菌群间Beta多样性距离有显著性差异。在门水平上,OVA致敏小鼠肠道厚壁菌门相对丰度显著下降,拟杆菌门和变形菌门相对丰度显著上升。AFB使OVA致敏小鼠肠道厚壁菌门相对丰度下降,拟杆菌门和变形菌门相对丰度上升,并以高剂量AFB影响最为显著。(3)采用ELISA法检测AFB对其释放生物活性介质β-氨基己糖苷酶(β-HEX)与组胺,以及细胞因子(IL-4、IL-6及IL-1β)释放量的影响;然后,采用Q-PCR分析对IL-4和IL-6的m RNA表达水平的影响。结果表明,AFB对OVA刺激KU812细胞脱颗粒释放β-HEX和组胺的影响较小,但能够促进其分泌细胞因子IL-4、IL-6以及IL-1β,释放量分别提高59%、30%及84%。同时,IL-4和IL-6的m RNA基因的表达水平也被提高,分别提高60%和23%。综上所述,从整体动物模型、肠道菌群分析结果及体外细胞实验结果都证明AFB暴露会加重OVA致敏性。

关键词： 黄曲霉毒素B1   壳寡糖   组织病理学   氧化应激   差异表达基因  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB)是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物,广泛分布在粮食作物和加工食品中。与AFB有关的危害主要是致癌性、免疫毒性、基因毒性和肝脏毒性。在哺乳动物中,AFB暴露引起的急性和慢性肝损伤已在理论上得到证实,但对水生生物的毒性机制研究较少。壳寡糖(COS)是一种小分子量的低聚糖,具有很强的生物活性和抗氧化能力,是一种可能治疗AFB诱导的肝损伤的药物。本论文主要从三个方面对黄曲霉毒素B1诱导水生模式生物青鱂鱼肝脏毒性作用机制进行阐述:第一部分不同浓度的AFB暴露对青鱂鱼肝脏的急性损伤;第二部分壳寡糖(COS)对AFB诱导的青鱂鱼急性肝损伤的干预作用;第三部分通过RNA-Seq探究COS干预AFB诱导的青鱂鱼急性肝损伤的具体机制。实验具体的方法与结果如下:(一)通过对青鱂鱼单次腹腔注射低剂量组0.25g/L组(LA组)、高剂量组1g/L(HA组)的AFB72小时后,从生存率和生长状况、体重和肝重指数、肝脏组织病理学、肝功能损伤指标、肝脏氧化应激指标的变化和酶活的主成分分析几个表型的方面对AFB诱导的青鱂鱼肝损伤进行分析,发现随着浓度的升高,AFB诱发的青鱂鱼肝损的程度越高,并且酶活的异常升高往往会降低青鱂鱼的生存率,由此可知,AFB对青鱂鱼从表型上已造成了短时期无法恢复的毒性影响。(二)通过对青鱂鱼单次腹腔注射1g/L的AFB,和在注射前后分别从饲料中添加0.3%壳寡糖低剂量组(LCOS组)和0.6%壳寡糖高剂量组(HCOS组)的COS进行干预,并在其中添加了阳性对照组,在基础饲料中添加了0.5%公认的具有护肝作用的水飞蓟素(SIL),来评估不同浓度下的COS干预效果,从生存率和生长状况、肝脏组织病理学、肝功能损伤指标、肝脏氧化应激指标的变化和酶活的主成分分析几个表型的方面对COS干预AFB诱导的青鱂鱼肝损伤进行分析,发现随着COS浓度的升高,其干预效果也在逐步变好,尤其在高浓度下的COS干预效果甚至与SIL相差不大,并且COS的干预下,对酶活的异常升高起到了一定的抑制作用,在高浓度的COS和SIL的干预作用下,能明显降低AFB诱发的青鱂鱼的死亡率。(三)通过RNA-Seq的技术,对青鱂鱼单次腹腔注射1g/L的AFB和在基础饲料中添加0.6%COS进行干预进行了比较,初步探讨了COS干预AFB诱导青鱂鱼急性肝损伤在基因层面的影响。从对比与CK组的差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)数量的变化和GO与KEGG富集分析方法,发现在COS的干预下,能在一定程度上减少AFB诱发的青鱂鱼肝脏基因毒性,并减少或增加与肝脏疾病相关的基因的异常表达。综上所述,COS可以干预AFB诱导的青鱂鱼急性肝损伤。本文中分别探讨了不同浓度下AFB的毒性作用,和不同浓度下COS的干预效果,为AFB诱发的肝脏损伤机制和COS的干预机制有了初步的探索,有助于开发天然活性物质如COS等,为AFB诱发的肝病提供新的治愈方法。

关键词： 玉米   含水率   黄曲霉毒素B1   嗅觉可视化技术   特征筛选   定量检测  

摘要： 玉米是我国的重要粮食作物,当玉米的品质安全受到危害时,会影响人们的身体健康。本研究以含水率作为玉米的品质指标,以黄曲霉毒素B（Aflatoxin B,AFB）浓度作为安全指标。现有的玉米含水率和AFB浓度检测技术存在操作复杂、成本高、检测时间长等缺点。因此,本研究以玉米为研究对象,探讨了基于嗅觉可视化技术的玉米含水率和AFB的定量检测方法研究。具体研究内容如下:（1）基于嗅觉可视化技术的玉米含水率检测方法研究。利用自制的嗅觉可视化检测系统获取玉米样本的挥发性气体信息,以图像的形式表征;利用RRelief F算法对颜色分量进行特征权重排序,结合支持向量机回归（support vector regression,SVR）确定最佳颜色分量组合;同时比较网格搜索（gride search,GS）和粒子群优化算法（particle swarm optimization,PSO）优化模型关键参数的能力;最后建立定量检测模型,以实现对仓储玉米含水率的快速检测。模型运算结果表明:相比于GS-SVR模型,RRelief F-GS-SVR模型的预测相关系数（correlation coefficient of prediction,R）从0.97提升到了0.98,预测均方根误差（root mean square error of prediction,RMSEP）由0.66%降低到0.53%;相比于PSO-SVR模型,RRelief F-PSO-SVR模型的R从0.98提升到了0.99,RMSEP由0.59%下降到0.48%。整体研究结果表明:利用嗅觉可视化技术可以实现玉米含水率的快速定量检测;此外,进行特征筛选和模型参数优化可以进一步提升模型的检测精度和泛化性能。（2）基于嗅觉可视化技术的玉米AFB浓度检测方法研究。利用多子空间无监督特征选择（feature selection approach based on multi-subspace randomization and collaboration,SRCFS）算法结合支持向量机回归和反向传播神经网络（back propagation neural network,BPNN）模型对颜色分量特征进行优化以确定最佳的颜色分量组合;建立基于优化特征颜色分量的SVR和BPNN模型以实现玉米AFB的快速定量检测,在SVR模型校正过程中,利用粒子群优化算法来优化SVR模型的参数。模型运算结果显示:SVR模型的性能要优于BPNN模型;特征筛选后,PSO-SVR模型的R均值从0.9654提高到了0.9837,RMSEP均值从4.8045μg·kg下降到了3.5222μg·kg;最佳SRCFS-PSO-SVR模型的R和RMSEP分别为0.9898和2.8069μg·kg。研究结果表明:利用嗅觉可视化技术可以高精度实现玉米AFB浓度的定量检测。本研究论证了嗅觉可视化技术在玉米含水率和AFB浓度检测方面的应用价值,研究成果可为谷物品质安全检测的嗅觉可视化检测装置的设计和开发提供一种技术参考和理论依据,同时也为粮仓管理人员提供了一种新型、快速、准确的检测方法。

关键词： 黄曲霉毒素B1   骨碎补总黄酮   肉鸡胸肌   肉品质   拉曼光谱   代谢组学  

摘要： 鸡肉是人类膳食结构中非常重要的蛋白质来源,以其高蛋白、低脂肪、相对低廉的价格等特点深受消费者的青睐。然而,因饲料原料储存不当等原因导致的饲料霉变问题一直困扰着家禽养殖业的健康发展。以往研究报道饲料霉变的问题不仅影响家禽自身的健康,还威胁着禽肉的品质。黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种引起饲料霉变最常见的食源性霉菌毒素,可能在农产品的生产、储存和运输等多个过程中产生,且分布广泛、不易去除。中草药以其纯天然、高效低毒的特点,在肉鸡饲养过程中作为饲料添加剂得到了广泛的利用。其中,骨碎补总黄酮(TFRD)作为中草药骨碎补的主要提取物,具有免疫调节、抗炎、抗氧化等多种药理活性,可能在降低AFB1毒性,改善家禽肌肉品质等方面发挥着潜在作用。因此,本研究重点研究AFB1对动物源性食品中肉品质的毒性作用,以及TFRD如何降低AFB1的毒性作用。将160只21日龄爱拔益加肉鸡(AA肉鸡)随机分为对照组(CON组)、黄曲霉毒素B1组(AFB1组)、骨碎补总黄酮组(TFRD组)和治疗组(AFB1+TFRD组),每组4个重复笼,每个重复笼10只鸡,试验周期为7天。研究一:AFB1对肉鸡胸肌肉品质影响及TFRD治疗效果的研究选取21日龄AA肉鸡为试验动物,通过嗉囊注射50μg/kg体重剂量的AFB1进行暴露并通过基础饲粮中添加125 mg/kg剂量的的骨碎补总黄酮进行治疗,观察临床症状,对肉品质相关指标进行检测。结果如下:(1)肉鸡进行AFB1暴露后,AFB1组胸肌比重显著高于CON组肉鸡胸肌比重(p<0.05),AFB1组胸肌的品质参数(如:肉色、p H、滴水损失)有所改变,胸肌肉色亮度L值相较于CON组发生显著性的下降(p<0.05),24小时后AFB1组肉样的p H值显著高于其余三组(p<0.05),AFB1组滴水损失相较于TFRD组有显著性升高(p<0.05)。(2)肉鸡进行AFB1暴露后,低频核磁共振试验发现CON组相比AFB1组胸肌中不流动水显著增加(p<0.05),质构分析中发现AFB1组胸肌质地(如:硬度和弹性)相较于对照组发生显著性下降(p<0.05)。(3)TFRD具有治疗效果,能够有效恢复胸肌的质地,改善胸肌肉品质,TFRD组胸肌肉色黄度b*值相较于CON组发生显著性的下降(p<0.05),AFB1组滴水损失相较于TFRD组有显著性升高(p<0.05),TFRD组相较于AFB1组质构分析中硬度、弹性、胶着性、咀嚼性、回复性都有显著性的上升(p<0.05)。研究二:基于代谢组学研究AFB1及TFRD对肉鸡胸肌代谢物影响选取CON组、AFB1组、TFRD组和AFB1+TFRD组胸肌样本进行代谢组学分析,所有数据分析均基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建的MWDB数据库。对鉴定的代谢物进行PCA分析、三元分析和KEGG富集分析。此外,筛选差异代谢物并通过皮尔逊相关性(Pearson)检验,分析肉品质相关参数与各组间差异代谢物之间的关系。(1)基于广泛靶向代谢组技术分析,共检测到762个代谢产物。OPLS-DA分析显示各组样本有明显分离,AFB1对肉鸡胸肌代谢造成了严重的干扰。(2)试验组之间明显不同的代谢物进行KEGG富集分析的结果显示,AFB1暴露引发代谢物主要在初级胆汁酸生物合成、赖氨酸降解、亚油酸代谢、胆固醇代谢和胆汁分泌方面富集。此外,补充TFRD后代谢物主要富集在氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢方面。(3)胸肌差异代谢物与肉品质密切相关,异亮氨酸-精氨酸和精氨酸-亮氨酸与肉色-a*呈正相关(p<0.05)。胸肌p H值与异亮氨酸-精氨酸、精氨酸-亮氨酸和丙氨酸-酪氨酸明显正相关(p<0.05)。剪切力和牛磺鹅去氧胆酸之间有明显的正相关(p<0.05)。(4)肉鸡进行AFB1暴露后TFRD补充可能影响肉鸡胸肌的蛋白质二级结构,拉曼光谱检测发现胸肌肌肉的纤维二级结构,AFB1组的ɑ-螺旋结构的含量明显高于AFB1+TFRD组(p<0.05)。研究三:AFB1引起的胸肌氧化损伤及TFRD的治疗效果的研究为探究氧化应激和炎症损伤在AFB1暴露引起肉品质损伤中的作用机制,采用肉鸡血浆进行氧化标志物和抗氧化酶活性的检测,并采用RT-q PCR检测胸肌组织抗氧化和炎症因子相关基因的表达水平。与代谢组筛选差异性代谢产物进行皮尔逊相关性分析,进一步探究差异代谢物与氧化炎症相关参数之间的潜在关系。(1)肉鸡进行AFB1暴露后,氧化应激与炎症相关指标发生了变化,添加TFRD可以逆转AFB1对肉鸡胸肌炎症和氧化应激的影响,与AFB1组相比,AFB1+TFRD组的肉鸡胸肌中SOD和CAT表达水平明显升高(p<0.05),与AFB1组相比,AFB1+TFRD组的肉鸡胸肌中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的m RNA表达明显下降(p<0.0

关键词： 黄曲霉毒素B1   光催化降解   碳氮聚合物   磷钨酸银   油脂  

摘要： 本文通过自组装、原位固相热转化法制备出碳氮化物(CN)修饰的磷钨酸银光催化剂(CN-Ag PW);通过自组装、原位固相热聚合法制备出聚酰亚胺(PI)修饰的磷钨酸银光催化剂(MAPI)。研究了制备温度、前驱体比例对催化剂的化学结构、晶体结构、光吸收、光生载流子分离迁移的影响。研究了所制备的复合催化剂可见光催化降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的性能,结合复合光催化剂的能带结构,分析了其可见光催化降解AFB1性能增强的原因,并揭示了其光催化降解AFB1的机理。以三聚氰胺(MA)、硝酸银(Ag NO)、磷钨酸(HPW)为前驱体,热转化温度为390℃,MA:HPW:Ag的摩尔比为5:2:1时制备出复合光催化剂5-CN-Ag PW-2,在λ≥420 nm光照下,催化剂用量为0.40 g·L,光照时间为120 min时,5-CN-Ag PW-2光催化降解水体系中AFB1的降解率为79.32%,速率常数k为0.72 h,是CN-390、Ag PW-390的12.95和12.50倍。在同样的光照条件下进行了油脂中AFB1光催化降解性能测试,催化剂用量为5.0 g·kg时,AFB1的降解率为92.65%,降解速率常数k为1.06 h,光催化反应前后,油脂品质未发生明显变化。以MA、Ag NO、HPW、均苯四甲酸二酐(PMDA)为前驱体,热转化温度为325℃,MA:HPW:Ag:PMDA摩尔比为5:1:2:5时,催化剂浓度为0.10 g·L,在λ≥420 nm光照下,光照时间为100 min时,5-MAPI-2光催化降解水体系中AFB1的降解率为75.80%,速率常数k为0.68 h,是Ag PW-325的7.34倍。在同样的光照条件下进行了油脂中AFB1光催化降解性能测试,催化剂浓度为2.5 g·kg时,AFB1的降解率为93.00%,降解速率常数k为1.05 h,光催化反应前后,油脂品质未发生明显变化。CN-Ag PW复合催化剂表征和降解结果表明,磷钨酸银均匀分散在CN层状结构中,改善了电荷在CN层间难转移的问题,但其占比过高会导致复合催化剂的酸性增强,从而影响底物AFB1的吸附;同时,CN的参与有助于提高复合催化剂的光生载流子的界面迁移和分离。PI结构中,吸电子基团的存在增强了π电子离域Ag PW与PI形成Type-Ⅱ型异质结,也利于光生载流子的分离。MAPI复合催化剂表征和降解结果表明,POM-π相互作用和成分间密切接触有利于增强电子离域和复合材料中的电荷迁移。利用紫外可见漫反射光谱(UV-Vis DRS)、X射线光电子能谱价带谱(VBXPS)分析CN-Ag PW、MAPI系列光催化剂的能带结构,通过电子顺磁共振(ESR)和自由基捕获实验,对光催化降解AFB1的主要活性物质进行检测,推断出碳氮聚合物/磷钨酸银复合光催化剂的电子迁移形式为Z-Scheme,光催化降解AFB1的主要活性物质为·O、·OH和h。

关键词： 辣椒干   黄曲霉   AFB1   气调贮藏   枯草芽孢杆菌   生防菌  

摘要： 辣椒（Capsicum annuum L.）是贵州地区的主要特色经济作物之一,但辣椒在种植、干制、运输和贮藏过程中易受到黄曲霉（Aspergillus flavus,***）及其产生的黄曲霉毒素B（aflatoxin B,AFB）的污染。辣椒干霉变不仅会造成巨大的经济损失,还严重损害了人类的健康。本研究通过收集省内十个主栽品种的辣椒干,分离鉴定主要污染的黄曲霉,围绕控制黄曲霉的生长条件和生物防控两个方面展开系统研究,为解决辣椒干贮藏中黄曲霉及AFB的控制提供理论依据。主要研究结果如下:1.从贵州省内采集了10个主栽品种的辣椒干样本,对辣椒干样本中的致霉变真菌进行分离、纯化。经过形态学鉴定和分子鉴定,从辣椒干中共分离出56种真菌,包括6株黄曲霉,其中4株是产毒黄曲霉。2.通过单因素实验和响应面优化实验,使用气调库贮藏辣椒时,当温度为5.13℃,O浓度为6.76%,CO浓度为6.42%时能有效控制高产毒黄曲霉的生长及其产生AFB的量。3.筛选出一株*** E11作为辣椒干贮藏期的生防菌。E11对黄曲霉的菌丝有较强的抑制能力,在24 h时能降低81.34%的AFB。扫描电镜观察发现E11的发酵上清液能使黄曲霉菌丝发生变形和皱缩。E11和高产毒黄曲霉回接辣椒干共同培养10 d,发现E11能显著抑制黄曲霉在辣椒干上的生长并维持辣椒干的品质,且与对照组相比,加入E11菌液的辣椒干中AFB的产量降低了51.79%。研究发现通过控制黄曲霉的生长条件,结合生物防治喷涂E11菌液能有效控制黄曲霉的生长和AFB的产生。研究为辣椒干的安全储藏提供了技术支撑,为延长辣椒干货架期提供了理论依据。

关键词： 围绝经期   卵巢功能   HUMSCs   hUCBP   铁死亡   中药  

摘要： 随着社会的进步和医疗技术的发展,女性平均寿命逐年增加,围绝经期综合征（perimenopausal syndrome,MPS）将困扰越来越多女性。围绝经期卵巢功能的衰退是引发MPS最主要原因,但是雌激素分泌减少引发其他生物学行为改变的机制尚未明确。激素替代疗法（Hormone replacement therapy,HRT）被推荐为治疗MPS的一线治疗方案,但由于其副作用和风险,在我国实际使用率低,因此寻找其它有效的治疗方式尤为重要。研究证明人脐带间充质干细胞（HUMSCs）可以改善鼠围绝经期卵巢功能,但是机制尚未明确。人脐带血浆（human umbilical cord blood plasma,hUCBP）作为HUMSCs的同源生物制品,其改善衰老的作用也逐步成为研究热点。筛选有效的中药制剂更是国内寻求MPS治疗方案的重点。本研究选择两种诱因不同的围绝经期模型,给予不同的制剂进行治疗,观察其对卵巢功能衰退的改善作用并探究机制,为临床治疗MPS提供更多选择。目的:1.探讨围绝经期卵巢功能衰退是否和铁死亡发生相关;2.探讨HUMSC改善围绝经期卵巢功能是否可以通过抑制铁死亡实现;3.探讨hUCBP是否可以通过抑制铁死亡改善围绝经期卵巢功能;4.探讨中药提取物A、B是否可以改善围绝经期卵巢功能。方法:第一部分:HUMSCs改善围绝经期卵巢功能的研究。建立两种诱因导致的围绝经期模型。自然衰老围绝经期模型:选取动情周期紊乱的14-15月龄SD大鼠,随机分为模型组和治疗组（每组30只）,以正常3月龄SD大鼠作为对照组,治疗组每日尾静脉注射HUMSCs 1 × 106cells/mL× 1mL ×2d,对照组和模型组注射等剂量生理盐水。VCD致围绝经期小鼠模型:选取8周龄雌性ICR小鼠,模型组和治疗组给予4-乙烯基环己烯二环氧（VCD）160mg/（kg·d）ip×20d;对照组给予等剂量芝麻油。治疗组每日尾静脉注射HUMSCs 1 × 106cells/mL × 0.2mL × 2d,对照组和模型组注射等剂量的生理盐水。分别在末次注射后7、14、21d每组随机处死10只鼠,用ELISA法检测血清中的雌二醇（E）、抗苗勒管激素（AMH）、促卵泡激素（FSH）水平,H&E染色观察卵巢组织结构并进行卵泡和黄体计数,生化法检测卵巢组织Fe、脂质氧化物（MDA）、谷胱甘肽（GSH）水平,Western Blot分析大鼠卵巢中铁死亡相关蛋白SLC7A11、DMT1、ACSL4、GPX4的表达情况。第二部分:hUCBP改善围绝经期卵巢功能的研究。建立VCD致围绝经期小鼠模型,随机分为模型组和hUCBP低、中、高剂量治疗组（每组30只）。各治疗组小鼠分别给予hUCBP隔日尾静脉注射175μL、240μL、300μL/只,分别于第一次注射后的7、14、21d处死10只动物,ELISA检测血清中的E、AMH、FSH水平,H&E染色观察卵巢组织结构并进行卵泡和黄体计数,生化法检测卵巢组织Fe、MDA、GSH 水平.。第三部分:中药粗提物改善围绝经期卵巢功能的研究。建立VCD致围绝经期小鼠模型,随机分为模型组、阳性对照组和中药粗提物A低、中、高剂量治疗组和B低、中、高剂量治疗组（n=10）。中药粗提物A或B低、中、高剂量治疗组小鼠分别给予灌胃中药粗提物A或B 0.75mg/g、1.5 mg/g、3.75 mg/g×28d;阳性对照组给予戊酸雌二醇灌胃0.009mg/kg×28d。末次给药后处死动物,ELISA检测血清中的E、AMH、FSH、LH,H&E染色观察卵巢、子宫组织结构并进行卵泡和黄体计数。结果:第一部分:HUMSCs改善围绝经期卵巢功能的研究。自然衰老围绝经期模型:与对照组相比,模型组大鼠动情周期延长且紊乱,卵巢指数下降;原始卵泡和初级卵泡数显著降低,闭锁卵泡数显著升高（P<0.05）。与模型组相比,给予HUMSCs后治疗组动情周期缩短,趋于正常,卵巢指数上升;原始卵泡、初级卵泡数显著增多,闭锁卵泡数显著减少（P<0.05）;血清E、AMH水平显著升高（P<0.05）,且随时间增加逐渐上升,血清FSH水平显著降低（P<0.05）,且随时间增加逐渐降低;卵巢组织Fe、MDA水平显著降低（P<0.05）,且随时间增加逐渐降低;GSH水平显著上升（P<0.05）,且随时间增加逐渐上升。VCD致围绝经期模型:与对照组相比,模型组小鼠动情周期延长,动情周期紊乱,卵巢指数下降,原始卵泡和初级卵泡数显著降低,闭锁卵泡数显著升高（P<0.05）。与模型组相比,给予HUMSCs后治疗组动情周期缩短,趋于正常;原始卵泡、初级卵泡数显著增多,闭锁卵泡数显著减少（P<0.05）;治疗组血清E、AMH水平显著升高（P<0.05）,且随时间增加逐渐上升,血清FSH水平均显著降

关键词： 黄曲霉毒素B1   郝克氏青霉   生物降解   鉴定  

摘要： 黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)是真菌毒素中的一种,多存在于谷物中,被世界卫生组织认定为Ⅰ级致癌物,对人类健康和经济发展存在巨大威胁。AFB高效经济的脱去已成为研究人员广泛关注的问题,生物降解AFB因其具有低成本、高效率和良好的安全性而被重点关注。本研究调查分析了我国部分地区稻谷、小麦、玉米及其制品中真菌毒素和重金属的污染现状,筛选出了可高效降解AFB的菌株并进行鉴定,优化其生长条件,初步探究其降解机理及特性。具体研究结果如下:通过检测我国部分地区稻谷、小麦、玉米及其制品中真菌毒素和重金属的含量,统计分析真菌毒素污染现状。结果表明,稻谷及其制品中真菌毒素检出率由高到低依次为ZEN>AFB>AFB>AFG>DON>AFG;小麦及其制品中AFB和DON毒素都呈现高阳性率,但超标率维持在较低水平;玉米及其制品中ZEN检出率高达100.00%,超标率为4.44%。稻谷和米粉及其制品中重金属检出率由高到低依次为镉>铅>汞,超标率由高到低依次为铅>镉>汞。通过与AFB共培养筛选可高效降解AFB的菌株。结果表明,从62株菌株中筛选出11株可降解AFB的菌株,其中MD1与AFB共培养72 h后对AFB的降解率高达99.2%,经形态学和ITS r DNA基因鉴定,确定菌株MD1为郝克氏青霉(Penicillium herquei)。通过对郝克氏青霉MD1降解AFB的条件进行优化,提高郝克氏青霉MD1降解AFB的降解率。结果表明,单因素实验显示接种量为2%,转速为160 r/min,培养基初始p H为7,培养时间为72 h,培养温度为28℃时,菌株MD1与AFB共培养24 h后对AFB的降解率最高。响应面优化实验显示以培养温度为28℃、培养基初始p H为8、接种量为1%时菌株MD1与AFB共培养24 h后对AFB的降解率可达到最大值,优化后测得的AFB降解率较单因素优化(86.84%)提升了11.73%。通过分离郝克氏青霉MD1菌悬液中的菌体和发酵液,探究其菌悬液、菌体、孢子液、发酵液降解AFB的有效部位,并将有效部位菌体破碎后作进一步探究。结果表明,培养72 h后的郝克氏青霉MD1菌悬液和未破碎菌体对AFB降解率分别为98.15%和28.20%,菌体破碎后对AFB的降解效果更好,培养24 h后对AFB的降解率为55.40%。