关键词： 瘢痕成纤维细胞   有效成分   中药提取物   活性成分  

摘要： 目的:本课题前期实验表明,大黄、三七、丹参具有较强的抑制瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖的作用,故进一步探索3种中药抗HSF增殖作用的物质基础,明确其中主要作用成分,研究其作用机制,并考察3种中药提取物抗HSF增殖的最佳配比。<br>　　方法:采用索氏提取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、饱和正丁醇和水对大黄、三七和丹参进行提取,制备各溶剂提取样品;以抗 HSF增殖的活性为导向,MTS法筛选各味中药的活性提取部位,筛选出的活性提取物采用流式细胞仪检测其对细胞周期的影响。采用 HPLC或 UPLC对其活性提取物进行谱效关系分析,Q/TOF推测出活性较高的成分,利用 PharmMapper数据库对活性化合物进行反向分子对接分析,将预测的靶点利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路数据库进行通路注释和分析,得出相关通路,预测其抗细胞增殖的机制。选取具有代表性的活性化合物,MTS实验和细胞 HE染色验证其抗增殖活性;以组分隐丹参酮为例,RT-PCR检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、双特异性丝裂原活化蛋白激酶1(MAP2K1)和丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)增殖相关基因的表达水平。最后采用D-最优混料设计,考察3种中药提取物抗HSF增殖的最佳配比。<br>　　结果:大黄乙酸乙酯提取物、三七乙酸乙酯提取物和丹参石油醚提取物有较高的抗 HSF增殖活性,流式细胞术结果显示这3个中药提取物均能显著增加 G0/G1期细胞的比例,显著降低S期和 G2/M细胞数的比例,明显降低增殖指数。<br>　　结合Q/TOF分析结果及文献报道,推测抗 HSF增殖抑制的主要成分分别是:大黄中的大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、没食子酸等;三七中的人参皂苷Rg1、三七皂苷R2、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1等;丹参中的二氢丹参酮I、丹参新醌B、隐丹参酮、次甲丹参醌和丹参酮II A等;反向对接结果显示,大黄活性成分可能通过CyclinA、CDK2等主要靶点,与Cell cycle、VEGF等信号通路相关;三七活性成分可能通过MAP2K1、MAPK14、HRAS等主要靶点,与MAPK、Focal adhesion等信号通路相关;丹参活性成分可能通过 MAP2K1、Caspase-3、MAPK14等主要靶点,与VEGF、MAPK、Focal adhesion等信号通路相关。<br>　　分别以大黄素、大黄酸、没食子酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1和隐丹参酮为例的验证结果显示,这几种成分均能抑制细胞的增殖且呈剂量依赖性;RT-PCR验证结果显示,隐丹参酮能够上调 Caspase-3基因的表达,同时下调MAP2K1、MAPK1基因的表达,与预测结果相吻合。<br>　　采用D-最优混料设计法考察出3种中药提取物抗HSF增殖的最佳配比为:丹参石油醚提取物为40％、大黄乙酸乙酯提取物为35%、三七乙酸乙酯提取物为25%。<br>　　结论:大黄、三七和丹参的主要活性成分分别为蒽醌类化合物、皂苷类、丹参酮类化合物,其作用的机制可能与调节MAPK、VEGF、Cell cycle、Focal adhesion等信号通路有关。丹参石油醚、大黄乙酸乙酯及三七乙酸乙酯提取物抗HSF增殖的最佳配比为8:7:5。

关键词： β-环糊精   应用  

摘要： 环糊精有多种同系物，常见的是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，其中以β-环糊精及其衍生物在药剂学上应用最为广泛。小分子药物与β-环糊精制成环糊精包合物后，能显著改善药物理化性质，为解决部分中药制剂中的难题提供有效方法。

关键词： 免疫磁珠   痕量   黄曲霉毒素B1   酱油   ELISA  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1,AFB1)是一种有毒的次级代谢产物,世界癌症机构将其归类为Ⅰ类致癌物,而作为中国传统发酵食品的酱油却广泛存在不同程度的黄曲霉毒素B1污染。研究表明,即使是痕量的黄曲霉毒素B1,长期的摄入也存在很大的危险性。所以建立一种快速检测AFB1的方法具有重要意义,特别是对于痕量的AFB1样品的检测。 通过优化抗体的偶联条件和黄曲霉毒素B1的前处理条件,成功建立了酱油中的免疫磁珠富集方法,结合酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测黄曲霉毒素B1。该方法所用的总时间为2h,最佳条件如下：pH7.40.02M PB缓冲液作为偶联体系,抗体与磁珠的比例为55μg/mg,20%的甲醇-PBS作为AFB1的前处理体系。以ELISA作为检测方法,在0.05μg/kg～0.3μg/kg AFB1的范围内具有良好的线性关系(R2=0.9842)。在酱油中添加0.5μg/kg～7μg/kg黄曲霉毒素B1的平均加标回收率为83.6%～104%,相对标准偏差为4.2%～11.7%。同时评价了两种不同方式制备的免疫磁珠在酱油中富集AFB1的效果,分别是直接法和间接法。直接法是抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体直接偶联到磁珠表面所制备的免疫磁珠;间接法是生物素化的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体偶联到链霉亲和素磁珠表面所制备的免疫磁珠。结果表明,直接法免疫磁珠的抗体偶联率高于间接法免疫磁珠的抗体偶联率,但间接法免疫磁珠在用量更少的条件下,对AFB1回收效果高于直接法的免疫磁珠,特别是对于痕量的AFB1样品。对于含5ng的AFB1酱油样品,直接法的免疫磁珠需要0.5mg的用量,而间接法的免疫磁珠只需要0.3mg用量。 免疫磁分离法作为酱油的前处理方法,与传统的有机溶剂萃取法和免疫亲和柱法作了比较。结果表明,免疫磁分离法所用的时间最短,而且AFB1回收率高,特别是对于痕量的AFB1样品。由于免疫磁分离法是基于一种动态的热力学反应过程,相比其它的前处理方式,该方法具有很大的优势。相对于传统的有机溶剂萃取法,该方法具有回收率高、时间短、操作简单、有机溶剂用量少等优点;而相对于免疫亲和柱法,该方法具有成本低、时间短、前处理简单及灵敏度高等特点。通过液相色谱-串联质谱法对ELISA检测结果的验证,说明免疫磁分离法联合ELISA检测AFB1的准确性和可行性。 该方法具有快速简便、设备简单、灵敏度高、准确性好、回收率高等优点,可很好地应用于酱油中黄曲霉毒素B1的快速检测,特别是痕量的AFB1的样品。

关键词： 黄曲霉毒素B1   单克隆抗体   iELISA  

摘要： 黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）主要是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生的毒性极强的次生代谢产物，黄曲霉毒素是一类结构类似的化合物的总称。在黄曲霉毒素家族中，常见的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2等。早在1988年黄曲霉毒素B1被国际肿瘤研究机构（IARC）定为一级致癌物。传统的检测方法不但耗时耗力，成本偏高，而且还需要专业技术人员对分析仪器进行操作。采用免疫化学分析法进行检测则可以克服以上缺点。本文旨在筛选出能分泌抗AFB1的高亲和力的单克隆抗体细胞株，为建立免疫化学检测方法打下基础。 首先用碳二亚胺法（EDC）构建了两种完全抗原AFB1-BSA和AFB1-OVA，其中AFB1-BSA作为免疫原免疫两只8周龄BALB/C雌性小鼠四次，AFB1-OVA作为包被原包被酶标板，iELISA法测定免疫小鼠血清效价。加强免疫后，两只小鼠的效价分别达到了128000和32000。采用PEG（4000）法将SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞进行融合，HAT筛选培养基筛选培养，经过3～4轮筛选得到三株能稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株：1B7、5A8、5B8。其中，1B7和5A8细胞株分泌的单克隆抗体为IgM亚型，5B8细胞株分泌的抗体为IgG1亚型。为便于后期纯化，本次实验采用5B8细胞株进行后续实验。经测定，5B8细胞株分泌的单克隆抗体效价达到20,0000，亲和力为7.96×108。将该细胞株进行扩大培养并注射到13周龄雌性Balb/c小鼠腹腔中，一周后取腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水，经SDS-PAGE检测可以看到明显的重链和轻链条带，证明单克隆抗体纯化成功。

关键词： 中药制剂   不良反应   控制  

摘要： 中药制剂应用广泛,长期以来一直被认为是药性平和、无毒副作用.随着人们对药品不良反应意识的提高,中药制剂的不良反应问题也逐渐显现出来,据某药品不良反应监测中心监测发现,中药制剂的药品不良反应报告占到总报告数的23.2%,而且新的药品不良反应报告主要来源于中药制剂.本文从药材基源、制剂类型、原材料质量等方面分析了中药制剂的不良反应的形成原因,并相应地提出了控制措施.

关键词： 中药制剂   骨科大手术   静脉血栓   栓塞症  

摘要： 目的：探究使用中药制剂对于预防骨科大手术静脉血栓栓塞症49例患者的实际效果。方法以我院2010年11月01日到2013年05月01日收治的98例骨科大手术患者为研究对象，平均随机分为2组，每组49例患者，分别称为对照组和实验组，对照组采用普通西药制剂预防骨科大手术静脉血栓栓塞症，实验组则采用中药制剂预防骨科大手术静脉血栓栓塞症。比较2组的治疗效果，进行统计学分析。结果采用普通西药制剂预防骨科大手术静脉血栓栓塞症的总有效率为（79．59％），采用中药制剂预防骨科大手术静脉血栓栓塞症的总有效率为（93．88％），实验组比对照组的有效率明显高，差异显著（P＜0．05）。结论对骨科大手术患者使用中药制剂预防静脉血栓栓塞症的效果显著，值得临床推广！

关键词： 中药注射剂   合理使用   不良反应   制剂稳定性   药物安全性   中药制剂   评价体系   临床应用   临床使用   工艺机理   反应研究   重现   事件   炮制   规范  

摘要： 目前中药不良反应研究存在的主要问题有5 点: ①对中药自身的认识不足;②炮制工艺机理阐述欠缺;③制剂稳定性和重现性较差;④药物安全性评价体系不完善;⑤药物临床使用不规范.上述观点的出现与中药临床应用的复杂性有关,因此,我们在使用中药制剂时,要合理使用,降低不良反应事件,鉴于此,合理使用中药注射剂应遵循以下原则.

关键词： FAT DISTRIBUTION   OBESITY   BAICALIN   HYPERTENSION   INHIBITION   WOMEN   SUPPLEMENTATION   PREVALENCE   SAPONINS   GINSENG  

摘要： We investigated the effects of herbal extracts, a mixture of Scutellariae Radix and Platycodi Radix containing the active ingredients Baicalin and Saponin (target herbal ingredient (THI)), on lowering body weight. The present study was a prospective, randomized, double-blind, and placebo-controlled trial carried out at the outpatient department of a hospital over a period of 2 months. Group 1 patients (n = 30) received THI, and group 2 patients (n = 23) received placebo three times a day before meals. Weight, waist circumference, BMI, total cholesterol, triglycerides, HDL cholesterol, LDL cholesterol, and glucose were measured at baseline and again at the 2nd month. For safety evaluation, various hematological and biochemical parameters were assessed. Values of mean change of weight in the THI-treated group were -1.16 +/- 1.41 kg and in the placebo-treated group were -0.24 +/- 1.70 kg, respectively. The difference in mean change of weight in the THI-treated group compared with that in the placebo-treated group was statistically significant (P < 0.05). The incidence of subjective and objective adverse drug reactions was insignificant (P > 0.05). THI was statistically significant in its effectiveness on the weight loss.

关键词： 黄曲霉毒素B1   降解菌株   筛选   鉴定   机理   雏鸭   解毒  

摘要： 黄曲霉毒素是最为普遍的一种霉菌毒素,具有极强的毒性,其对粮食作物和饲料的污染,给我国畜牧业造成巨大的经济损失,因此研究其脱毒措施十分必要。微生物降解脱毒因其高效、无污染、处理条件温和等优点成为一种新的黄曲霉毒素脱毒研究方向。本试验从土壤中筛选出高效黄曲霉毒素B1(AFB1)降解菌株并对其鉴定,同时研究了其降解物质成分和影响降解的主要因素,并通过动物试验研究了降解菌株饲用的安全性及有效性。1 AFB1降解菌株的筛选、鉴定以香豆素为唯一碳源,从多环芳烃化合物污染的土壤中筛选出11株AFB1降解菌株,其中T3-5菌株对AFB1的降解效果最强,降解率为94.16%。结合该菌株的形态特征、生理生化反应以及16SrDNA测序结果,鉴定该菌株为芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium funkei)。2芬氏纤维微菌对AFB1的主要降解物质和体外脱毒的适宜条件分别研究了菌株胞外液、胞内液以及菌体细胞对AFB1的脱毒效果。结果显示菌株的胞外液对AFB1的降解能力最强,降解率为96.82%。胞外液主要降解活性物质对热不敏感。胞外液经过蛋白酶K+0.5% SDS处理后对AFB1的降解率降至42.19%。用70%硫酸铵沉淀提取的酶对AFB1降解能力最强,降解率为53.61%。该结果表明菌株对AFB1的降解作用是其胞外代谢产物中酶和其它活性成分共同作用的结果。当菌株培养温度为35℃、培养基pH为6.5,发酵时间在18h以上,降解时间为72 h时可达到最佳降解效果。当反应体系AFB1含量为1μg时,0.5 mL胞外液对AFB1可达到最大降解率。3芬氏纤维微菌饲用安全性研究60只4日龄樱桃谷肉鸭,随机分为3个组,每组4个重复,每个重复5只鸭。所有试验组饲喂标准日粮,试验组Ⅰ～试验组Ⅲ分别经口灌服：1 mL无菌LB培养基;1 mLT3-5菌液(1×108 cfu/mL);1mL T3-5菌液(1×1010 cfu/mL);各组每天灌胃1次,连续灌胃7 d。试验期间记录雏鸭采食量和日增重。于试验第7d和14 d,每个重复随机选取1只雏鸭,颈静脉放血致死。取样,测定血清生化指标、盲肠菌群和肝脏病理学切片。结果表明,添加T3-5对雏鸭平均日增重和平均日采食量无显著影响(P>0.05),可以显著降低雏鸭料重比(P<0.05)。T3-5的添加对雏鸭血清AST、ALT的活性以及TP、ALB、UN的含量影响差异不显著(P>0.05),可以显著降低盲肠大肠杆菌的含量(P<0.05),对盲肠总需氧菌、总厌氧菌、乳酸菌和双歧杆菌含量影响差异不显著(P>0.05)。灌服T3-5 1周后可以在盲肠内容物检测到该菌的存在,停止灌服1周后,盲肠内容物检测不到该细菌。每天灌服108cfu的T3-5对鸭肝脏组织结构无影响。4芬氏纤维微菌体内降解有效性研究60只4日龄樱桃谷肉鸭,随机分为3个组,每组4个重复,每个重复5只鸭。所有试验组饲喂标准日粮,试验组Ⅰ～试验组Ⅲ分别经口灌服：1 mL无菌LB培养基;0.1 mg/kg-BW的AFB1溶液+1 mL无菌LB培养基;0.1 mg/kg-BW的AFB1溶液+1 mL T3-5菌液(1×108cfu/mL)。各组每天灌胃1次,连续灌胃14 d。试验期间记录雏鸭采食量和日增重。于试验第7d和14 d,每个重复随机选取1只雏鸭,颈静脉放血致死。取样,测定血清生化指标、盲肠菌群和肝脏病理学切片。结果表明,AFB1暴露雏鸭与空白对照组相比,平均日增重显著降低,料重比显著升高(P<0.05)。血清AST、ALT和UN显著升高(P<0.05),血清TP和血清ALB显著降低(P<0.05)。雏鸭肝细胞肿胀、变性和坏死,胆管严重增生。盲肠大肠杆菌数量显著升,乳酸菌数量显著降低(P<0.05)。与AFB1暴露雏鸭相比,对AFB1暴露雏鸭添加T3-5菌对雏鸭平均日采食量无影响,有提高雏鸭平均日增重的趋势(P>0.05),显著降低暴露雏鸭料重比(P<0.05),达到空白对照组水平。同时显著降低雏鸭血清AST和ALT的活性(P<0.05),显著降低大肠杆菌和总需氧菌的数量(P<0.05),有增加乳酸菌和双歧杆菌的趋势,但差异不显著(P>0.05)。雏鸭灌服1周的AFB1,添加T3-5可明显缓解AFB1对肝脏的损伤作用。当AFB1灌服时间为2周时,T3-5细菌对肝脏损伤无明显缓解作用。结论：本试验筛选出了对AFB1具有较强降解能力的芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium funkei) T3-5,发挥降解作用的主要成分是其胞外代谢产物。动物试验表明该菌能改善雏鸭的生长性能,当加菌剂量为1×108cfu时对雏鸭肝脏和肾脏无损伤作用。该菌经过胃肠道环境可存活,不能在肠道定植,可降低盲肠大肠杆菌的数量。该菌可改善AFB1对雏鸭生长性能的影响,缓解AFB1对

关键词： Pseudomonas stutzeri F4   发酵   AFB1降解酶   分离纯化   酶学性质  

摘要： 黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物,具有强毒性和致病性。在食品和饲料中,黄曲霉毒素污染现象非常普遍,这不仅对食品业和农牧业造成了严重经济损失,而且对人类及动物的健康带来巨大的威胁,因此受到了广泛的重视。在前期工作中,我们分离到了能高效降解黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)的菌株——施氏假单胞菌F4(Pseudomonas stutzeriF4),在此基础上,本论文针对F4产生的AFB1降解酶(AFB1-degrading Enzyme, ADE)进行了研究。通过优化发酵条件,提高产酶水平,对ADE分离纯化方法,及其酶学性质进行了研究。主要结果如下： 1.以Pseudomonas stutzeri F4的产酶条件进行考察和优化。选择与产酶相关的种龄、接种量、起始pH值、发酵时间以及温度等5个因素,以ADE酶活为评价指标,在单因素试验的基础上,通过三因素三水平的Box-Behnken响应面分析法优化施氏假单胞菌发酵产ADE的条件。结果表明,在接种量和起始pH值分别为3%和6.5时,最优发酵条件理论值为种龄10.5h、发酵时间42.5h、温度30.3℃,在此培养条件下,发酵液的ADE酶活可达到2769U,比优化前提高了29%。 2.降解AFB1酶的分离纯化。用55%的硫酸铵沉淀处理,得到粗酶液,用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱进行纯化后,出现三个洗脱峰,于第三个峰(±132～152min)检测出酶活,且在±144min时相对酶活最大,为55%。然后通过Superdex G-100层析柱进一步纯化,结果出现两个洗脱峰,于第二个峰(±920-1200min)检测出酶活,且在±980min时相对酶活最大,为45%。110mg的ADE原酶液通过55%硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化后,ADE纯化了123倍,总蛋白量为0.5mg,酶活为32×103U,比酶活为64×103U/mg,表明其纯化效果良好。 3.基于纯化的酶,研究了F4菌株产生的ADE的相关特性。结果显示,ADE相对分子质量约为24kDa,其与AFB1反应的最适温度和pH值分别为30℃和6.0,Cu2+对ADE酶有抑制作用,其他几种金属离子(Mg2+、Zn2+、Mn2+和Fe3+)对其影响不大。最后,利用双倒数作图法测得其表观Km值为5.61×10-5mol/L。