关键词： 纳米抗体   类弹性蛋白多肽   递归定向连接   非柱亲和沉淀   高效液相色谱  

摘要： 黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等丝状真菌产生的双呋喃环类毒素,在其多至20种衍生物中,黄曲霉毒素B(AFB)毒性最大,致癌性最强,可导致人类肝癌和食道癌。黄曲霉毒素主要污染谷物类、油料类及其制品,在动物源性食品中也可累积存在。AFB的检测方法主要包括薄层层析法(Thin-layer chromatography,TLC)、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)、荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)以及生物传感器等,其中现行国家标准中HPLC与ELISA仍为主要检测方法。由于待测样品基质复杂、种类繁多,样品的前处理对于AFB高效分离,降低或避免基质干扰,实现准确定性、定量检测具有重要意义。目前存在的各类真菌毒素样品提取方法包括液相萃取法(Liquid-liquid extraction,LLE)、固相萃取法(Solid-phase extraction,SPE)、免疫亲和层析法(Immunoaffinity chromatography,IAC)等,存在操作复杂,污染环境,特异性低,成本高昂等缺陷。本研究将类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,ELPs)与抗AFB的纳米抗体G8融合表达,建立了一种在均相样品反应体系中快速提取AFB的非柱亲和沉淀方法。该方法原材料的制备仅依赖于微生物的生物合成,无需固相载体与抗体之间的有机偶联即可获得大量重组蛋白,极大降低了真菌毒素的提取成本,简化了实验流程,结论如下:利用同尾酶DraⅢ与BglⅠ实现了ELP重复序列的递归定向连接(Recursive directional ligation,RDL),合成了p ET30a-G8-ELP20,p ET30a-G8-ELP40,p ET30a-G8-ELP60,p ET30a-G8-ELP80表达载体。各表达载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖(Isopropyl-β-D-thiogalactopyra noside,IPTG)诱导表达12 h,破碎离心后得到分子量分别为26KDa、34 KDa、43 KDa、51 KDa的四种重组蛋白包涵体。在含8 M尿素的变性缓冲液中4℃孵育12 h使包涵体蛋白充分溶解,分别采用稀释复性、可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)纯化、透析复性、柱上复性四种方式对包涵体蛋白进行复性。SDS-PAGE分析四种复性方式分别获得的四种融合蛋白,结果显示,纯度差异不显著,但ITC纯化蛋白得率最高,分别为83%、90.7%、89.5%、88.3%;间接竞争ELISA测定复性后的融合蛋白活性,结果表明由稀释复性法获得的G8-ELP80重组蛋白IC最低(4.35 ng/m L);浊度分析法测得融合不同长度ELP标签纳米抗体的相变温度(The phase transition temperature,Tt)分别为45℃、38℃、32℃、28℃,与预期变化规律一致;圆二色谱分析显示四种融合蛋白二级结构均以β折叠、β转角为主,与预估结果相符。采用The Minimate EVO system浓缩复性后的250 m L蛋白溶解液,浓缩后得到25 mg储存浓度为766μg/m L的重组蛋白G8-ELP80,蛋白得率为31.25mg/L。通过间接竞争ELISA建立标准曲线测定AFB回收率,对ELP标签长度、抗原抗体反应比、甲醇耐受、盐离子种类与浓度、体系p H等影响捕获效率的各项因素进行了单因素优化。实验结果显示,ELP标签最佳重复单元数为80个重复,投入抗体与AFB标准品的最佳反应比为3:1,重组蛋白的最高甲醇耐受浓度为10%,用于重组蛋白相变聚沉的最佳盐离子为终浓度0.6 M的(NH)SO,体系的最佳反应p H为7.0。在单因素优化后的条件下,测定了G8-ELP80相变前后的粒径,分别为1μm与4μm,相变后粒径为原来的4倍,进一步证明G8-ELP80具备良好的相变能力。测定了不同浓度下G8-ELP80在上述相变条件下的蛋白沉降率。结果表明,当捕获体系中重组蛋白的终浓度达到0.3 mg/m L以上时可实现90%以上的重组蛋白沉降。为考察样品基质对G8-ELP80捕获AFB的影响,选取玉米、大米、植物油、酱油等四类待测样品进行加标回收实验,均加入低(10μg/kg),中(50μg/kg),高(

关键词： 微嗜酸寡养单胞菌A2   黄曲霉毒素B1   生物降解   小鼠   鹌鹑  

摘要： 黄曲霉毒素是一类由曲霉属真菌产生的双呋喃环类毒素,其分布广,检出率高,对人或动物的机体造成严重伤害,其中以黄曲霉毒素B(AFB)的毒性最强,属于一类高致癌物质。生物降解法是目前饲料中最有应用前景的黄曲霉毒素去毒方法,但微生物或者酶去毒机理研究不够深入、在机体中安全性不够清晰,限制了其在生产中的应用。寻找安全、高效的微生物是去除AFB的有效途径。本论文围绕黑水虻肠源性微嗜酸寡养单胞菌A2降解AFB的作用机制、安全性和有效性开展了系统的研究。(1)微嗜酸寡养单胞菌A2降解黄曲霉毒素B特性与机制分析研究A2菌培养液降解AFB活性成分存在部位,以及降解AFB的影响因素。结果表明,A2菌降解AFB的活性成分主要位于发酵液上清;在p H 8～9时,上清液中AFB的降解效率最高;在20～70℃温度范围内,AFB的降解率逐渐增加,40℃后增加缓慢;48h以内随着反应时间的延长,降解率逐渐增加,24 h达到87%,24h以后降解率增加缓慢;AFB浓度在100～1000 ng/m L,随着浓度增大降解率减少,1000 ng/m L降解率为65%;Zn显著抑制了A2菌上清液对AFB的降解,而Cu、Mn、Mg、Ca和Fe对AFB降解率影响较小。采用液相色谱-串联质谱鉴定A2菌降解AFB产物的结构式。结果显示,在保留时间为8.9min时,鉴定出一种新生化合物,通过化合物碎片离子推断出新生化合物是在母体呋喃环上脱去-C=O和香豆素环上脱去-CH3生成的。为了更进一步探寻活性物质,对A2菌进行二代和三代测序,以目前已知的黄曲霉毒素降解酶基因为目标序列,在A2菌基因组中进行Blastp比对,寻找降解酶,并通过分子对接模拟探寻酶作用AFB的关键氨基酸位点。结果表明,A2基因组中的漆酶ALc对AFB降解发挥作用,降解机制为:微嗜酸寡养单胞菌A2编码的漆酶ALc通过四个氨基酸位点对AFB进行作用,生成母体呋喃环上脱去-C=O和香豆素环上脱去-CH3的产物,降低了AFB的毒性作用。(2)微嗜酸寡养单胞菌A2对AFB诱导下黑水虻幼虫的影响研究A2菌对AFB诱导下的自然幼虫和除菌幼虫生存率、体长、干重、幼虫转化率等生长指标的影响,和对虫沙中AFB含量的影响。结果显示,A2菌显著提高了AFB诱导的幼虫生长性能和降解AFB的能力。(3)微嗜酸寡养单胞菌A2对小鼠安全性分析每天给小鼠灌胃0.2m L/10g体重剂量的A2菌液,试验14天。结果显示:A2组小鼠的常规指标(生长性能、血常规、血清生化指标)、肝脏和肾脏组织的抗氧化指标(总抗氧化活力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛)、肝脏(IL-β和TNF-α)和脾脏(CD3、CD4、CD8及CD4/CD8)的免疫指标以及肝脏组织病理学切片均与对照组间无显著差异。说明A2菌对小鼠是低毒甚至是无害的。(4)微嗜酸寡养单胞菌A2对采食AFB污染日粮鹌鹑的影响添加不同剂量(1kg/T和2kg/T)的A2菌剂,试验30天,采集样品进行检测。结果显示,A2菌改善了AFB对鹌鹑的料蛋比、肝脏和脾脏指数、血清生化指标(ALP、ALT、TG和CREA)、肝脏和肾脏组织抗氧化指标(总抗氧化活力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛)、肝脏(TNF-α和IL-β)和脾脏组织指标(CD3、CD4、CD8及CD4/CD8)、肝脏大体形态学和组织病理学的影响,缓解了对鹌鹑盲肠微生物菌群造成的破坏,且随着A2菌添加浓度增加,改善效果越明显。本论文揭示了微嗜酸寡养单胞菌A2产生的漆酶ALC通过四个氨基酸作用位点,将AFB转化为呋喃环脱去-C=O和香豆素环上脱去-CH3的产物,降低了AFB毒性。A2菌对AFB诱导的黑水虻幼虫生长起到促进作用、去除AFB起到协同作用,对采食AFB的鹌鹑有一定的保护效果,对小鼠无毒害作用。本论文的研究为A2菌微生物制剂的开发与应用提供理论支持。

关键词： 奶山羊   支持细胞   自噬   乳酸分泌   黄曲霉毒素B1  

摘要： 黄曲霉毒素B1(Aflatoxins B1,AFB1)是由霉菌产生的次级代谢产物,在小麦、玉米、大豆、坚果等农作物及其副产品的运输、储存等多个环节中广泛存在。在畜禽养殖过程中,采食黄曲霉毒素能够引起畜禽生殖系统多方面损伤,其中雄性畜禽表现为精液品质降低及生育能力下降。睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)在维持和调节正常的生精过程中发挥举足轻重的作用,其乳酸分泌的稳定是生殖细胞正常发生的关键。AFB1能够造成睾丸损伤,引起精子发生障碍,然而目前关于AFB1对睾丸SCs的影响及潜在机制尚未明确。因此,本研究以奶山羊SCs为研究对象,首先通过检测AFB1处理前后细胞葡萄糖利用率、丙酮酸含量、乳酸脱氢酶活性及乳酸分泌量的变化,以明确AFB1对SCs乳酸分泌的影响;其次通过透射电镜、Western blot及Compound C与AICAR处理对细胞自噬进行检测,以探究AFB1对SCs自噬的影响;之后,使用氯喹(Chloroquine,CQ)及雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)对SCs进行预处理,通过检测乳酸分泌的变化以明确自噬在AFB1介导的SCs乳酸分泌下降中的作用;最后,基于实验室先前的研究结果,在SCs培养基中添加构树黄酮,探究其对AFB1引起的乳酸分泌损伤及自噬的影响,从而明确调控自噬以缓解AFB1介导的奶山羊SCs乳酸分泌障碍的可能性,为缓解黄曲霉毒素导致的奶山羊公羊生殖毒性提供理论依据。本研究主要获得以下结果:1.采集2～3月龄的奶山羊睾丸,两步酶消化法获得奶山羊原代SCs。通过免疫荧光对SCs特异性标志物WT1和SOX9进行鉴定,使用流式细胞仪对染色结果进行分析,结果显示WT1-CY3和SOX9-FITC细胞的百分比分别为94.7%±1.2%和92.0%±1.8%;在AFB1处理SCs 24 h后,用CCK-8测定细胞活力,表明当AFB1的浓度高于5μM时,SCs的活力呈现出明显的剂量依赖性下降(P<0.001);当AFB1的浓度超过20μM时,随着AFB1浓度的增加其细胞毒性也极显著增加(P<0.01);与对照组相比,AFB1处理能够引起SCs葡萄糖摄取量、乳酸分泌水平、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸水平呈浓度依赖性的极显著下降(P<0.01);Western blot结果表明,参与乳酸分泌过程的关键蛋白GLUT1、GLUT3、LDHA和MCT4的表达在AFB1处理后极显著下降(P<0.01)。上述结果表明,AFB1可以抑制SCs的乳酸分泌。2.在奶山羊支持细胞培养基中添加AFB1处理24 h,使用透射电子显微镜观察细胞内自噬样结构的变化,结果表明AFB1处理后细胞内自噬样结构增多;Western blot结果表明,AFB1处理后细胞内LC3-II/I的比率及p62蛋白降解水平显著增强(P<0.05),且AMPK及ULK1的磷酸化水平极显著增加(P<0.01);使用50μM AICAR和10μM Compound C对AFB1处理的SCs进行预处理,Western blot结果表明,Compound C预处理极显著降低AFB1处理后LC3-II的蛋白水平(P<0.01),且极显著增加了p62的表达(P<0.01);AICAR预处理可极显著诱导AFB1处理后细胞自噬通量的上调(P<0.01);使用CQ和Rapa对AFB1处理的SCs进行预处理,发现CQ抑制自噬会极显著降低AFB1处理组细胞的葡萄糖消耗、丙酮酸产生、乳酸产生和乳酸脱氢酶活性(P<0.01),而Rapa极显著逆转AFB1诱导的乳酸分泌的减少(P<0.01);Western blot结果表明,抑制自噬后AFB1处理组GLUT1、GLUT3、LDHA和MCT4的表达极显著降低(P<0.01),而自噬增强则显著逆转这些蛋白表达的下降(P<0.05)。以上结果表明,AFB1能够通过AMPK/ULK1信号通路增强SCs内自噬通量,而增强的自噬在一定程度上能够减轻其诱导的SCs乳酸分泌的减少。3.在奶山羊SCs培养基中添加构树黄酮与AFB1处理SCs 24 h,通过CCK-8测定细胞活力,10μM和25μM构树黄酮处理能够显著增强AFB1处理后SCs的活力(P<0.05);构树黄酮处理能够极显著缓解AFB1引起的葡萄糖摄取量、乳酸脱氢酶活性、丙酮酸水平及乳酸分泌水平的下降(P<0.01);同时,培养基中添加构树黄酮能够显著增加GLUT1、GLUT3、LDHA和MCT4的蛋白表达水平(P<0.05);此外,构树黄酮处理能够极显著增强SCs中LC3-II/I的比率及p62蛋白的降解(P<0.01)。以上结果表明,构树黄酮可能通过增强自噬来缓解AFB1引起的SCs乳酸分泌下降。综上所述,本研究发现10μM以上剂量的AFB1能够减少SCs葡萄糖摄取,抑制乳酸分泌,并

关键词： 姜黄素   电化学传感器   重金属   甲基对硫磷   黄曲霉毒素B1  

摘要： 谷物是我国主要粮食作物,其在生产、加工、运输、储存过程中易受到污染,对谷物中危害物建立快速、灵敏的检测方法至关重要。电化学法是谷物中危害物检测的常用方法,具有响应速度快、操作方便、灵敏度高等优点,能够有效检测谷物中的危害物。谷物中危害物检测存在目标物浓度低、基质干扰强的问题,寻找稳定的信号标记物,使检测结果具备稳定性和信号放大作用,提高检测的灵敏度显得尤为重要。姜黄素（CCM）是一种天然色素,具有良好的电化学活性和化学稳定性,可将其与纳米材料结合提高电化学检测的灵敏度。本论文以姜黄素纳米复合材料修饰电极,构建了检测重金属镉离子(Cd)和铅离子(Pb)、甲基对硫磷（MP）、黄曲霉毒素B（AFB）的电化学传感器。具体研究内容及结果如下:1.基于姜黄素构建的比率型电化学传感器检测谷物中镉和铅在修饰多壁碳纳米管（MWCNTs）/层状水滑石（LDHs）的玻碳电极表面电化学聚合CCM,构建比率型电化学传感器检测谷物中Cd和Pb。LDHs表面富含羟基和多种层间阴离子,其可以对重金属离子进行富集。MWCNTs具有大的比表面积和良好的电导率,MWCNTs和LDHs可以发生协同作用,为重金属在电极表面吸附提供更多的结合位点,从而提高检测的灵敏度。引入CCM作为电化学内置参比探针,减少基质干扰及杂质干扰,使电化学传感器具有更好的稳定性、准确性和抗干扰能力。基于此,根据I/I和I/I的比值,构建比率型电化学传感器实现对Cd和Pb的检测。在最佳条件下,Cd和Pb的检测限（limit of detection,LOD）分别为0.61μg/m L和0.74μg/m L。我们进一步将该方法用于米粉和面粉样品中Cd和Pb的检测并获得了满意的回收率。2.基于姜黄素-MOF的电化学传感器检测谷物中甲基对硫磷水热法合成金属有机框架Ui O-66,并以Ui O-66对CCM的吸附作用制备CCM/Ui O-66纳米复合材料。基于Ui O-66对MP的吸附富集作用和CCM与MP之间的π-π作用,CCM/Ui O-66纳米复合材料可以显著增强电化学检测的灵敏度。基于此,构建了一种用于快速、灵敏检测MP的非酶电化学传感器。在最佳条件下,该方法对MP的检测范围为20 ng/m L～20000 ng/m L,LOD为0.98 ng/m L。该电化学传感器具有优异的特异性、良好的稳定性、再现性和重复性,在米粉和面粉加标实验中的回收率分别为97.00%～110.73%和97.70%～114.30%。3.基于姜黄素和沸石咪唑骨架-8的电化学免疫传感器检测谷物中黄曲霉毒素B采用仿生矿化方法将CCM包埋在沸石咪唑骨架材料-8（zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8）中,制备CCM@ZIF-8,并在其表面修饰聚多巴胺（polydopamine,PDA）层,以制备CCM@ZIF-8/PDA。以CCM@ZIF-8/PDA复合物与免疫球蛋白G（immunoglobulin G,Ig G）偶联,合成CCM@ZIF-8/PDA/Ig G。利用材料的信号放大作用和Ig G的免疫识别作用,采用间接竞争免疫法对AFB进行电化学检测。在最佳条件下,随着AFB浓度的增加,电化学响应值在0.0005 ng/m L～10 ng/m L范围内递减,LOD为0.11 pg/m L,同时该电化学免疫传感器的特异性、稳定性、重复性、再现性都达到可接受的水平,AFB在米粉和面粉中的加标回收率分别为86.65%～105.20%和92.60%～104.60%。使用高效液相色谱法（HPLC）与所提出方法的检测结果进行比较验证,两者检测结果一致,证明了所提出的电化学方法具有一定的准确性和实用性。

关键词： AFB1   脾脏   线粒体自噬   氧化应激   线粒体损伤  

摘要： 黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)可蓄积于脾脏,造成脾脏免疫功能抑制。氧化应激是AFB发挥免疫毒性的病理基础,并可引发线粒体损伤。磷酸酶及张力蛋白同源物诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligase PARK2,Parkin)介导的线粒体自噬可清除损伤线粒体,维持细胞正常结构和功能,但其是否参与AFB所致的脾脏免疫功能抑制及其作用尚不清楚。据此,本研究提出“PINK1/Parkin介导的线粒体自噬参与AFB致小鼠脾脏免疫功能抑制”的理论假说,首先,将60只野生型(Wild tape,WT)C57BL/6雄性小鼠分为对照组(Control group,CG)给予0 mg/kg AFB、低剂量组(Low dose group,LG)给予0.5 mg/kg AFB、中剂量组(Medium dose group,MG)给予0.75 mg/kg AFB和高剂量组(High dose group,HG)给予1 mg/kg AFB,试验周期为28 d;检测小鼠生长状况、脾脏免疫功能、氧化和抗氧化指标、线粒体结构和功能及PINK1/Parkin信号通路关键因子的表达,旨在揭示线粒体自噬与AFB所致脾脏免疫功能抑制之间的相关性,分析其剂量-效应关系,筛选出后续Parkin基因干预试验所用AFB剂量;随后,将30只WT雄性C57BL/6小鼠和30只Parkin敲除(Parkin knockout,Parkin)雄性C57BL/6小鼠随机分为野生型对照组(Wild type control group,WAG)给予0 mg/kg AFB、野生型AFB暴露组(Wild type AFB expose group,WAG)给予1 mg/kg AFB、Parkin敲除对照组(Parkin knockout control group)给予0 mg/kg AFB和Parkin敲除AFB暴露组(Parkin knockout AFBexpose group)给予1 mg/kg AFB,试验周期为28 d;检测PINK1/Parkin信号通路关键因子的表达、小鼠生长状况、脾脏免疫功能、氧化和抗氧化指标及线粒体结构和功能,旨在揭示PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是否参与AFB暴露引起的小鼠脾脏免疫功能抑制及其发挥的作用。试验结果如下:(1)AFB毒性试验结果1)与CG相比,MG和HG小鼠体重和脾脏/体重系数显著降低,脾脏显微结构显著损伤,表明AFB可诱导小鼠生长发育抑制和脾脏结构损伤。2)与CG相比,MG和HG小鼠脾脏白介素-2(Interleukin-2,IL-2)、IL-4、IL-6和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因表达显著降低,表明AFB可诱导小鼠脾脏免疫功能抑制。3)与CG相比,LG、MG和HG小鼠脾脏活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量显著升高,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性显著降低,表明AFB可诱导小鼠脾脏氧化应激。4)与CG相比,MG和HG小鼠脾脏组织细胞线粒体超微结构显著损伤,线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)含量显著降低,表明AFB可诱导小鼠脾脏线粒体结构损伤与功能抑制。5)与CG相比,MG与HG中PINK1、Parkin、泛素粘附调节因子P62蛋白(Sequestosome1,P62)和微管相关蛋白l轻链3(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3)基因表达显著升高。与CG相比,HG中PINK1、磷酸化Parkin(Phosphorylation-Parkin,p-Parkin)、P62和LC3II蛋白表达显著升高,表明AFB可激活小鼠脾脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。综上,小鼠暴露于1 mg/kg AFB时,脾脏免疫功能被抑制,同时自噬强度最高,故选择此剂量用于后续Parkin基因干预试验。(2)Parkin基因干预试验结果1)与WAG相比,PAG中PINK1、P62和LC3基因表达显著下降,PINK1、P62和LC3II蛋白表达显著下降。说明Parkin--可抑制小鼠脾脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。2)与WAG相比,PAG小鼠体重和脾脏系数均显著下降,脾脏显微结构损伤加剧,说明PI

关键词： 黄曲霉毒素B1   骨碎补总黄酮   肉鸡   抗氧化   肠肝轴   胆汁酸代谢   铁死亡  

摘要： 黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)已被国际癌症研究机构评估为已知毒性最强的化学致癌物之一,肝脏是其主要靶器官。此外,胃肠道作为接触霉菌毒素的直接器官,AFB1暴露会损伤其黏膜屏障功能,破坏肠道菌群结构。肠道菌群的平衡对动物消化吸收、免疫调节等至关重要。因此,维持肠道菌群稳态可能是改善AFB1毒性损伤的潜在途径。中药提取物骨碎补总黄酮(Total flavonoids of Rhizoma Drynariae,TFRD)是从蕨类植物的干燥根茎中提取的天然黄酮类化合物,其对AFB1诱导的肉鸡肝脏损伤具有一定保护作用。因此,本试验旨在探讨AFB1诱导肝脏损伤的作用机制及TFRD的改善作用。本试验以90只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡为受试对象,肉鸡适应性饲养3周后,随机分为3组:对照组(CON)、AFB1组、AFB1和TFRD共处理组(A+T)。其中,AFB1组和A+T组嗉囊注射AFB1(100μg/kg体重,溶于4%乙醇),连续7 d,建立AFB1暴露模型。CON组嗉囊注射等量的4%乙醇,饲喂基础日粮;A+T组肉鸡在基础日粮中添加125 mg/kg的TFRD。探究AFB1对肉鸡肝脏损伤的毒性机制,以及TFRD通过调控肠-肝轴对AFB1诱导的肝损伤的保护作用,主要研究内容与结果如下:(一)探讨TFRD对AFB1暴露肉鸡肠道微生物稳态及肠道屏障的改善作用。对各组肉鸡十二指肠内容物进行16S r RNA测序分析,发现TFRD能够改善AFB1暴露引起的肠道微生物紊乱,且与胆汁酸代谢相关的微生物粪杆菌属(Faecalibacterium)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、瘤胃球菌属([Ruminococcus])在组间差异显著(p<0.05)。同时,补充TFRD有效改善了十二指肠肠道的形态结构损伤,通过增加隐窝杯状细胞的数目和黏蛋白MUC2的mRNA表达(p<0.05),以及紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的mRNA和蛋白表达水平(p<0.05),从而改善肠道屏障。(二)探讨胆汁酸代谢在AFB1暴露下的参与作用。本试验采集肉鸡血浆样品,利用广泛靶向代谢组学技术,研究不同处理条件下血浆样本之间的代谢产物差异。结合UPLC-MS/MS检测平台、自建数据库和多元统计分析方法,在CON组、AFB1组和A+T组的血浆中共鉴定出773种代谢产物。将鉴定出的代谢物进一步分析,在CON组与AFB1组共筛选出34个显著变化的代谢物,其中有15个上调,19个下调;在AFB1组和A+T组共筛选出57个显著变化的代谢物,其中17个上调,40个下调。KEGG富集分析差异代谢物,发现CON组和AFB1组差异代谢物主要富集在5-羟色胺能突触、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路、脂肪酸生物合成等通路;AFB1组和A+T组差异代谢物主要富集在初级胆汁酸生物合成、亚油酸代谢、胆汁分泌和硫代谢等通路。将CON和AFB1组,AFB1和A+T组间具有显著差异的共同代谢物作为潜在的生物标志物并进行韦恩分析,结果发现有9个共同差异代谢物,包括肌酸、3-N-甲基-L-组氨酸、L-肉碱、刺桐碱、三乙醇胺、L-酪氨酸甲酯4-硫酸盐、牛磺石胆酸、丙氨酸酪氨酸、肉碱C8:0。其中次级胆汁酸牛磺石胆酸在AFB1暴露后呈上升趋势,补充TFRD后显著下降(p<0.05)。另外,刺桐碱的相对含量在AFB1暴露后也显著增加(p<0.001),补充TFRD后显著下降(p<0.001)。提示两者在AFB1暴露肉鸡血浆代谢物中可能发挥解毒作用。此外,通过皮尔逊相关性分析发现差异血浆代谢物与肠道微生物密切相关,如牛磺石胆酸与瘤胃球菌属([Ruminococcus])、乳酸杆菌属(Lactobacillus)呈显著正相关(p<0.05),与罕见小球菌属(Subdoligranulum)呈显著负相关(p<0.05),进一步证明肠道微生物的紊乱影响胆汁酸代谢。(三)探讨TFRD缓解AFB1诱导的肝损伤的分子机制。在以上试验结果基础上,本试验分别检测了抗氧化酶活性水平以及脂质代谢关键调节因子和铁死亡关键基因的mRNA表达水平。首先TFRD有效缓解AFB1诱导的肝脏病理损伤,降低丙氨酸转氨酶(ALT)(p<0.001)和天冬氨酸转氨酶(AST)(p<0.01)活性,增加超氧化物歧化酶(SOD)(p<0.01)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)(p<0.01)和过氧化氢酶(CAT)(p<0.05)活性,降低氧化产物丙二醛(MDA)水平(p<0.01),提高抗氧化能力。另外,肝脏油红染色显示AFB1组脂质严重聚积(p<0.001),且血清总胆固醇(TC)(p<0.01)和甘油三酯(TG)(p<0.001)均升高,提示脂质代谢异常,而补充TFRD有

关键词： 二氧化钛反蛋白石   光电化学   生物传感器   黄曲霉毒素B1   饲料安全  

摘要： 黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉在霉变谷物中产生的强毒、强致癌物质,黄曲霉毒素广泛存在于玉米、小麦、燕麦、高粱等饲料和饲料原料中,对动物健康造成严重威胁,而且给养殖业带来了损失,还能通过肉类、蛋类、牛奶等动物产品进入人体,危害人类健康。因此,对于真菌毒素检测具有重要意义,常规分析检测方法有薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱法,但是这些分析方法样品处理繁琐,需要昂贵仪器和专业人员,很大程度上限制了应用。光电化学(Photoelectrochemical,PEC)生物传感器因其灵敏度高、背景信号低、成本低、设备简单、重现性好、高选择性、易用性、快速响应等优点,已发展成为有效分析工具,被认为是一种很有前景的真菌毒素检测方法。本论文是基于制备光电转换性能优良的三维二氧化钛反蛋白石结构(TiO inverse opal,TiO IO),通过合成硫化镉量子点(CdS QDs)和碳量子点(CDs QDs)与TiO IO形成纳米复合结构,构建了优良的光电化学生物传感平台,设计不同的光电化学生物传感方法,提出了多种新型的光电化学生物分析和光学可视化分析双信号检测方案,实现对饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)特异性高灵敏检测。首先,本论文成功制备了三维二氧化钛反蛋白石结构光电化学生物传感电极,并以此为基础,构建了一种基于酶促生物催化沉淀的,具有光电化学和光学可视化双信号输出的生物传感器平台,成功应用于模型目标物人Ig G分析检测。具体地,将CdS QDs修饰到通过模版法制备的TiO IO/FTO电极表面,并构建酶标记人Ig G三明治免疫复合物,碱性磷酸酶可以催化5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)生成灰紫色不溶性产物,阻碍电极界面电子转移从而抑制光电流产生。同时,在电极表面形成沉淀物具有颜色,人Ig G浓度与颜色强度相关,可作为光电化学信号补充及验证。该光电化学生物传感器具有较好的线性范围5 pg/m L-100 ng/m L,检出限0.15 pg/m L(S/N=3),该大孔反蛋白石结构PEC生物传感平台的成功构建为后续AFB1检测奠定了基础。其次,以丝素粉为原料水热合成了CDs QDs,以三维TiO IO为基底,制备了CDs/TiO IO/FTO电极,构建了一种新型光电化学生物传感器用于AFB1检测。具体地,TiO IO和CDs形成纳米复合结构,可见光利用率提高和带隙匹配效应,显著提高了其光电化学性能。由于CDs QDs表面羧基基团和AFB1适配体中氨基基团发生EDC耦合作用,可以将AFB1适配体固定在CDs QDs表面,目标物AFB1与适配体特异性结合,形成绝缘层,阻碍界面电子转移从而降低光电流。光电流降低变化量与AFB1浓度对数值呈线性关系,PEC生物传感器对AFB1检测线性范围为5 pg/m L-50ng/m L,检出限1.27 pg/m L(S/N=3)。此外,该光电化学生物传感器实现了实际样品玉米中AFB1的检测,充分证明了CDs/TiO IO光电化学生物传感器平台具有检测饲料原料中AFB1的巨大潜力。最后,对上述CDs/TiO IO/FTO电极进行改进,以酶促生物催化沉淀反应和适配体特异性识别为基础,成功实现了目标物AFB1高灵敏检测。具体地,首先制备CDs/TiO IO/FTO电极,将氨基修饰的AFB1适配体互补链固定到电极表面,通过杂交反应将碱性磷酸酶标记的适配体链(ALP-aptamer)引入电极。在AFB1不存在时,ALP-aptamer与互补DNA链杂交,ALP催化产生的沉淀可猝灭光电流;在AFB1存在时,AFB1与ALP-aptamer发生特异性生物识别反应,由于目标物与适配体间的亲和性大于DNA双链,因此竞争形成aptamer-AFB1复合物而脱离电极,从而光电流信号恢复,光电流的变化值与AFB1浓度成比例关系,所构建的光电化学生物传感器对AFB1检测线性范围为5 pg/m L-50 ng/m L,检出限2.38 pg/m L(S/N=3)。另外,ALP催化BCIP产生具有颜色的沉淀物,电极表面颜色强度与AFB1含量成比例关系,可进一步实现光学可视化分析。另外,该生物传感器成功实现了鸡饲料和饲料原料小麦面粉中AFB1检测,在饲料安全领域具有广阔的应用前景。本论文基于二氧化钛反蛋白石结构生物传感平台开发了多种新型光电化学生物传感器,实现了饲料及饲料原料中AFB1检测,为饲料及饲料原料其它毒素检测提供了新的思路,同时也有望应用于食品安全、环境保护、临床医学等领域重要目标物的分析检测。

关键词： 中药制剂分析   教学改革   中药传统技能竞赛   实验教学   教学模式   考核评价  

摘要： 针对职业院校中药制剂分析传统实验教学模式存在的教学方式陈旧、实验内容缺乏探索性、教学评价方式单一、课程思政缺失、学生学习主动性差等问题，融合全国职业院校中药传统技能竞赛，构建“一中心四层次”—“线上+线下”和“三个结合”为一体的教学与考核评价新模式，并合理融入课程思政。新模式下学生在全国职业院校中药传统技能竞赛、大学生创新创业大赛、实习就业等方面取得了不错的成效，真正达到了“赛教融合”的效果。该模式可作为提升中药制剂分析教学质量和全国职业院校中药传统技能竞赛成绩的一种借鉴。

关键词： 纳米酶   快速检测   胆固醇   过氧化钙   黄曲霉毒素B1  

摘要： 随着纳米科学与技术的发展,基于无机纳米材料的新型人工模拟酶(纳米酶)受到越来越多的关注,与天然酶相比,纳米酶具有反应条件温和、设计灵活、易修饰及稳定性高等独特优势。本文设计和合成了不同复合材料的纳米酶,探究了影响它们类酶活性的因素,并利用纳米酶优异的性质实现了对食品中胆固醇、过氧化钙和黄曲霉毒素B1的精确检测,旨在发掘具有高活性的纳米酶,从而实现更灵敏、快捷、经济的食品快速检测方法。本研究取得的主要成果如下:1.设计并组装了一种介孔二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒(FeO@Si O),该纳米颗粒具有内在的类过氧化物酶(POD)催化活性。介孔Si O可以保证纳米酶具有灵活的尺寸、良好的分散性和稳定性。对合成的FeO@Si O类POD样特性及最佳反应条件进行了探索,进一步对其稳态动力学及催化性能和机理进行了深入研究。通过将催化氧化诱导的显色反应与胆固醇氧化酶相结合,FeO@Si O可用于胆固醇的可视化比色测定,线性范围为10–300μM,检测限低至7.12μM。该方法成功应用于测定牛奶和蛋黄样品中的胆固醇含量的比色检测,具有低成本、准确、高效和特异性强的特点。2.通过组装二元铜锚定的介孔二氧化硅磁性纳米粒子(FeO@Si O@Cu O),制备了一种具有级联增强类POD活性的新型异相纳米酶。利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜、傅立叶变换红外光谱、X射线衍射仪和动态激光散射仪对所制备的纳米酶进行了表征。利用该异相纳米酶实现了面粉中Ca O的超灵敏可视化检测,其检测范围为0.1–5 m M,检测限为5.6×10 m M,且不受多种干扰物的影响,具有良好的特异性。3.基于上述FeO@Si O@Cu O纳米酶较高的类POD催化活性建立了一种用于安全高效检测谷物食品中AFB的间接竞争酶联免疫法。通过在FeO@Si O@Cu O纳米酶表面连接兔抗鼠二抗,代替天然辣根过氧化物酶标记的二抗,用于间接竞争酶联免疫法对小麦、玉米等谷物食品中AFB进行检测,该方法得出吸光度与底物浓度的对数值的线性关系良好,检测范围为0.06–61.93 ng/m L,检测限为0.0037 ng/m L。

关键词： 高职   中药制剂技术   课程思政  

摘要： 勤学为务，尤以立品为先。高职院校教育改革与发展必须以习近平新时代中国特色社会主义思想武装头脑，抓住改革核心环节，充分发挥专业课程和职业技能在高职育人中的主导作用，着力将思想政治教育贯穿于课程教学、技能培养的全过程。以药学专业中药制剂技术课程为例，基于课程特色和学情分析，挖掘“天人相应对立统一”“继承创新破立并举”“严谨求实工匠精神”“遵规守法、安全质量至上”四大思政主题，搭建同向同行的思政平台，研究考核评价体系，形成课程间协同效应。