关键词： 黄曲霉毒素B1   液相色谱-串联质谱法   克氏原螯虾   中华绒螯蟹   代谢  

摘要： 克氏原螯虾和中华绒螯蟹是江苏省重要的两种水产养殖动物,黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)等霉菌毒素的污染阻碍了两种甲壳动物的养殖发展和产品质量安全。因此,本研究建立了水产品中霉菌毒素的检测方法,并以克氏原螯虾和中华绒螯蟹作为研究对象,分析其AFB1入侵后的转录组和代谢组差异,主要结果如下:建立了免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定水产品中8种霉菌毒素残留。样品经乙腈水溶液(84:16,V:V)1提取,多毒素免疫亲和柱净化。色谱柱为Agilent Proshell 120 SB·C18(2.1 mm×100 mm,2.7μm),流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.4 m L/min,柱温为40℃。采用电喷雾离子源正负离子同时扫描,多反应监测模式(MRM)进行质谱检测。8种霉菌毒素在1.0～50.0 ng/m L范围内线性关系良好(R>0.992),方法检出限在0.05～0.5μg/kg之间,定量限在0.17～1.65μg/kg之间;8种霉菌毒素加标回收率在75.6%～106.3%之间,相对标准偏差(RSD)为3.5%～9.3%。该方法操作便捷、灵敏度高、准确可靠,能满足水产品中多种霉菌毒素残留快速检测需求。向克氏原螯虾注射60 mg/L的400μL的AFB1后分别在30min、60min、90min(A30、A60、A90)后取出其肝胰腺,分析AFB1造成的转录基因差异。结果显示,共鉴定了399个差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。KEGG注释得到的通路中,心肌收缩和心肌细胞中的肾上腺素能信号在三组比较均被显著富集到。GO注释后显示差异基因主要富集在肌肉蛋白纤维、细胞骨架、水解酶活性、糖类分解代谢、葡萄糖酶类活性等通路上。结果表明AFB1处理后克氏原螯虾肝胰腺中肾上腺素传导功能受到抑制,且糖类分解和葡萄糖酶活反应的生物学过程会产生重要作用。向雌性中华绒螯蟹注射400 u L 60 mg/L AFB1标准溶液,分别在30min和60min后取出其肝胰腺和卵巢,分析AFB1造成的转录基因差异及代谢物差异。结果显示对照组与两个实验组对比中,分别鉴定出210和250个DEGs,通过NR蛋白注释和GO注释显示,其中14个上调基因与抗菌解毒、ATP能量反应、氧化还原反应、神经反应、肝损伤修复和免疫反应等六大功能类别相关。在ML-C与ML-30 m和ML-C与ML-60m的比较中,共有228个和401个差异代谢物(Differential Abundant Metabolites,DAMs)富集在12条途径,包括角质素、类木质素和蜡质生物合成、酪氨酸代谢、嘌呤代谢、核苷酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、ABC转运体和色氨酸代谢等。通过对肝胰腺代谢组学和转录组的综合分析,发现了4条共富集的途径,包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、色氨酸代谢、酪氨酸代谢和嘌呤代谢,并在3条途径中发现DEGs和DAMs的相互作用关系,包括类固醇生物合成,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,以及鞘脂代谢,这些基因和代谢产物在蟹肝胰腺或卵巢对AFB1入侵的应答中起着重要作用。

关键词： 核酸适配体   纳米材料   比色法   层析试纸条   黄曲霉素B1  

摘要： 真菌毒素由于存在污染广、危害大、防控难、含量低、污染基质复杂等特点,已成为制约我国粮油食品产业发展的重要瓶颈。目前一线粮库入库大多采用的真菌毒素快速检测方法是层析试纸条检测技术,所用的检测设备和试纸条主要靠进口,而且进口的层析试纸条价格昂贵,检测误差较大,样品前期处理时间过长,已经不能满足我国粮食进仓检测需求。因此加快粮食中真菌毒素快速检测关键技术研究已成为保障我国粮食安全的迫切需求。本研究以粮食安全中具有代表性的黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)为研究对象,通过合成颜色信号稳定且强的纳米复合材料作为信号放大元件,同时将适配体作为识别分子代替抗体应进行靶标识别,制备了实验操作简单,信号响应快,结果可视化等特点的适配体比色传感器以及横向流动试纸条检测系统,实现对真菌毒素高灵敏的快速检测,同时扩大了检测范围,降低实验成本。具体研究结果如下:1胶体金适配体比色法检测玉米中的黄曲霉毒素B以不同尺寸和形貌的金纳米颗粒会呈现出不同的颜色,并且在外界环境因素的作用下,金纳米颗粒之间发生相互作用,从而造成其尺寸和溶液颜色发生变化以及共振峰发生移动为依据,本章将胶体金与核酸适配体通过静电结合作为信号探针,建立了胶体金适配体比色法检测玉米中的AFB。当溶液中含有AFB,根据AFB核酸适配体可以与靶标分子高特异性结合,导致适配体从胶体金表面脱落,从而使裸露在氯化钠中的胶体金溶液聚集,从而产生颜色和吸光度的变化,以此达到对AFB的可视化快速检测。通过对实验条件的优化,得出该方法的检出限(Limits of Detection,LOD)为0.5ng/m L,且在0.5～50 ng/m L范围内呈现良好的线性关系。通过对加标样品进行检测,得出该方法的加标回收率为90.3%～94.8%,相对标准偏差为7.3%～12.2%。2基于胶体金的适配体层析试纸条检测玉米中的AFB根据前一章所得到的实验结果,我们可以证明该实验所选用的适配体序列对AFB有较高的亲和力。为了提高AFB的检测准确度和灵敏度,基于传统抗原抗体的胶体金免疫层析试纸条的基础上,通过对已有的核酸适配体进行生物素修饰并代替抗体作为试纸条的识别分子,巯基修饰的互补链共价结合金纳米颗粒作为识别探针,同时将链霉亲和素作为试纸条的检测线,利用链霉亲和素与生物素的高亲和力捕获偶联物。最后肉眼观察条带颜色并使用胶体金免疫层析仪扫描以实现对AFB的定量检测。对影响实验结果的条件进行优化后,得出适配体试纸条法LOD为0.5 ng/m L,检测范围(IC～IC)为0.5～200 ng/m L。使用该方法对玉米样品中的AFB加标回收率为97.3%～120%,相对标准偏差为2.3%～8.3%。3基于花状MoS@Au复合纳米材料的适配体试纸条检测玉米中的AFB为了进一步提高检测的灵敏度,使试纸条显色效果更加明显。在前一章胶体金适配体试纸条的基础上,本章通过合成颜色信号稳定且强的纳米复合材料Mo S@Au代替单独的胶体金颗粒与巯基修饰的互补链共价结合作为试纸条的信号探针。根据花状的二硫化钼具有较大的比表面积,将胶体金附着在其表面的可以提高Au NPs的利用率,同时将生物素修饰的适配体代替传统试纸条中选用的抗体作为靶标识别分子,将链霉亲和素作为试纸条的检测线捕获生物素复合物。通过肉眼观察条带颜色并使用胶体金免疫层析仪扫描以达到快速、准确、定量检测AFB的目的。通过对关键因素的优化,得出基于花状Mo S@Au复合纳米材料的适配体试纸条LOD为0.3 ng/m L,检测范围为0.2～200 ng/m L,且该方法在1～50 ng/m L范围内具有良好的线性关系。试纸条对玉米样品的加标回收率为99.4～109.4%,相对标准偏差为3.2%～10.1%。

关键词： 花生油   黄曲霉毒素B1   液态样品自动混匀表面增强拉曼光谱采集系统   促凝剂  

摘要： 基于实验室自行研制的微量液态样品自动混匀表面增强拉曼光谱(SERS)采集系统，通过黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品和标准储备液的SERS对比分析，确定544、691、1278和1621 cm-1处的拉曼峰为花生油中AFB1的拉曼特征位移。利用QuEChERS(Quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)前处理技术，得到花生油中AFB1的提取液，考察了促凝剂种类及其浓度对提取液中AFB1检出限的影响，确定以1.2 mol/LKI溶液为促凝剂，采集了花生油中AFB1提取液的SERS特征信息，其检出限为0.02 mg/kg。基于采集的不同浓度AFB1花生油提取液的SERS光谱，分别建立了AFB1拉曼特征位移的一元线性回归、多元线性回归(MLR)和基于全光谱变量的偏最小二乘回归(PLSR)预测模型。因AFB1特征峰受溶液极性和基底变化的影响会发生偏移，利用全光谱的PLSR定量预测模型优势更为显著。为有效消除全光谱中无关变量同时确保AFB1分子结构和官能团的指纹信息，分别基于竞争性自适应重加权(CARS)、随机蛙跳(RF)和连续投影(SPA)3种算法筛选特征变量，建立AFB1定量PLSR预测模型，其中，CARS算法的效果最佳，其模型校正集相关系数为0.9961，均方根误差为0.02213 mg/kg。对此模型进行外部验证，决定系数为0.9792，均方根误差为0.04426 mg/kg。结果表明，此方法可用于花生油中AFB1的快速定量检测。

关键词： 适配体   MOFs   AgSAC   纳米金指示反应   SERS   RRS   黄曲霉毒素B1  

摘要： 随着社会稳步发展,人们关注的问题已经从“量”转变为“质”,其中食物安全便是一个广泛受到关注的问题,而在食品安全评估中的一项重要指标便是黄曲霉毒素B1(AFB1)的测定。AFB1是黄曲霉毒素(AFT)的一种衍生物,其在AFT所有衍生物中毒性最大,致癌性最强,人们误食这些被黄曲霉毒素污染的食品或其加工副产品后,又经消化道吸收毒素进入人体而中毒,可诱发肝癌变,甚至导致死亡,严重威胁人体健康。基于此,对食品中的AFB1的灵敏测定对食品安全和人体健康都尤为重要。近年来,单原子催化剂(SACs)凭借其最大的原子利用率和均匀的活性位点等优势逐渐成为多相催化领域的新前沿,尤其是以金属有机框架(MOFs)为底物合成SACs的开发更是成为研究热点。但以MOF为前驱体的高催化活性AgSAC的制备及其在分析化学中的应用鲜有报道,因此,在该方面的研究具有良好的应用前景。本文将银金属有机框架(AgMOF)及其单原子银催化剂应用于催化HAuCl-HMi氧化还原反应,反应产物(AuNPs)具有显著的表面增强拉曼散射(SERS)/共振瑞利散射(RRS)增强效应,通过结合适配体(Apt)对纳米材料催化活性的调控作用,设计了运用SERS/RRS技术检测AFB1的分析平台,并将其成功地应用于食品分析中。具体内容如下:以1,3,5-均苯三甲酸(HBTC)作为有机配体,选用第一副族的金属离子(Cu、Ag、Au)作为连接点,通过溶剂热法制得CuMOF/AgMOF/AuMOF,然后分别以制得的三种MOF为前驱物,采用微波辅助法制备CuSAC/AgSAC/AuSAC。接着以MOFs/SACs对HAuCl-HMi纳米反应催化效果的强弱作为评价标准,筛选出催化性能更优的AgSAC。为进一步证明AgSAC的高催化活性,以有机配体为底物制备碳点(CD),将CD/AuNP/AgNP同样作为催化剂,比较其催化活性,结果显示AgSAC的催化活性更高。为进一步研究制备条件对AgSAC及其前驱物AgMOF催化活性的影响,分别以配体与金属化合物配比、反应时间、反应温度以及AgMOF的用量为单一变量对其制备条件进行了优化。利用分子光谱、高分辨透射电子显微镜(TEM)、能量色散X射线光谱(EDS)、X射线光电子能谱(XPS)、X射线粉末衍射谱(XRD)等表征技术对AgMOF/AgSAC进行了表征分析。最终获得AgMOF和AgSAC的最佳制备条件,并且成功制备了催化性能更优的AgSAC,为进一步研究其对纳米反应的催化放大奠定了基础。随后将AgMOF/AgSAC应用于催化HAuCl-HMi纳米反应,实验发现,AgSAC对HAuCl-HMi纳米反应表现出强催化作用,生成具有强SERS和RRS效应的紫红色AuNPs。加入AFB1适配体(Apt)后,Apt通过静电吸附作用将AgSAC包裹,AgSAC的催化活性受到抑制,使得生成AuNPs减少,造成SERS和RRS响应信号降低。加入目标分析物AFB1后,AFB1与Apt特异性结合形成稳定结构,AgSAC被释放,使得AgSAC的催化活性得以恢复,AuNPs的生成量增加,SERS和RRS信号恢复,并且分析体系的SERS/RRS信号增量均与AFB1的浓度呈线性相关关系,从而实现了对0.005-0.225μg/L(SERS)和0.025-0.250μg/L(RRS)AFB1的定量分析检测,其检测限分别为0.002μg/L和0.008μg/L。此外,还考察了蔗糖等共存物质对AFB1检测的影响,并运用该方法对面条和玉米发糕样品中的AFB1进行了检测。结果显示共存物质对检测AFB1的影响,相对误差在±10%以内,实际样品中检测相对标准偏差(RSD)在0-6.5%之间,回收率在95.0-109.3%之间。以上结果均证明了该分析方法在实际应用方面的可行性,为食品中痕量真菌毒素的定量分析提供参考。同时我们采用分子光谱和电镜等技术对AuNPs指示反应体系进行了研究分析,提出了一个合理的催化反应机理。

关键词： 玉米   拉曼光谱   黄曲霉毒素B1   特征优化   卷积神经网络  

摘要： 玉米是重要的全球性粮食作物,在人类社会中占据着举足轻重的地位。黄曲霉毒素B（aflatoxin B,AFB）是玉米中广泛存在的真菌毒素之一,它严重威胁到人类的生命健康。因此,实现对玉米中AFB的快速检测不仅能够保障消费者的权益,还能指导农民和加工商采取措施来减少其污染。拉曼光谱具有非破坏性、分析效率高、无污染等优点已被广泛用于农产品中有害物质的检测。鉴于此,本研究拟开展基于拉曼光谱技术的玉米AFB污染程度定性识别和玉米AFB含量定量检测方法的研究。主要工作如下:（1）基于拉曼光谱技术的玉米AFB污染程度方法研究利用便携式拉曼光谱仪对霉变玉米样本进行拉曼光谱表征,并对获得的原始拉曼光谱进行适当预处理;使用主成分分析（principal component analysis,PCA）对预处理后的拉曼光谱数据进行特征重构,并分别建立基于重构主成分（principal components,PCs）的极限学习机（extreme learning machine,ELM）、K最近邻（k nearest neighbor,KNN）和支持向量机（support vector machines,SVM）识别模型。同时,针对预处理后的拉曼光谱特征,设计合理的一维卷积神经网络（one-dimensional convolutional neural network,1DCNN）结构实现拉曼光谱的特征自学习和识别模型校正。研究结果显示,最佳1DCNN模型和最佳SVM模型对独立样本的预测准确率都达到了100%。研究结果表明,利用拉曼光谱技术结合适当的化学计量学方法可以高精度实现玉米AFB污染程度的定性识别,研究结果可为谷物真菌毒素污染程度的快速监测提供方法参考。（2）基于拉曼光谱技术的玉米AFB含量检测方法研究利用竞争性自适应重加权采样（competitive adaptive reweighted sampling,CARS）和变量组合种群分析（variable combination population analysis,VCPA）算法来分别优化预处理后的拉曼光谱特征,并分别建立基于优化特征的偏最小二乘（partial least squares,PLS）和SVM检测模型。同时,针对预处理后的拉曼光谱特征,设计合理的1DCNN结构实现拉曼光谱的特征自学习和定量模型校正。研究结果显示,相比较于最佳PLS和SVM模型,1DCNN模型获得了最佳的检测性能,其预测决定系数（determination coefficient of prediction,R）和预测均方根误差（root mean square error of prediction,RMSEP）分别为0.9540和4.3823μg?kg。研究结果表明,利用拉曼光谱技术结合合适的化学计量学方法实现玉米AFB的定量分析是可行的,同时拓宽了深度学习在光谱化学计量学分析领域的应用范围。本研究将深度学习引入到拉曼光谱的化学计量学分析上,并成功实现了玉米AFB污染程度的定性识别和AFB含量的定量检测。研究结果为深度学习在光谱化学计量学领域的成功应用提供了方法参考。

关键词： 中药提取物   黄连素   多囊卵巢综合征   半乳糖凝集素-3   胰岛素抵抗  

摘要： 目的:观察黄连素对多囊卵巢综合征(PCOS)合并胰岛素抵抗(IR)的不孕症女性血清半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)及炎症因子和IVF助孕结局的影响,探讨Gal-3与PCOS发生的相关性以及黄连素改善PCOS-IR的可能作用机制,为黄连素在PCOS治疗中的应用及生殖领域的研究提供理论支持和临床依据。方法:将符合纳入标准的90例行IVF治疗的PCOS-IR患者随机分为黄连素组(治疗组45例)和二甲双胍组(对照组45例),在实施IVF治疗前,分别给予口服黄连素和二甲双胍治疗3个月。干预结束后,所有患者均采用拮抗剂方案超促排卵。检测干预前后的月经第3日血清性激素水平、血糖、胰岛素、血脂等相关指标;另取剩余部分血清送检,采用ELISA方法测定Gal-3、TNF-α和IL-6水平;计算患者的BMI值、HOMA-IR指数;于HCG日抽血测定性激素水平;统计患者Gn用量及使用天数、获卵数;计算受精率、优胚率、新鲜周期取消率等,随访比较两组的临床妊娠、早期流产情况,并将性激素水平、血糖、胰岛素、血脂指标与Gal-3含量进行相关性分析,应用SPSS26.0软件分析研究数据。结果:1.血清性激素水平:经药物治疗,两组患者月经第3日血清LH水平均得到有效改善(P<0.05),黄连素在改善第3日血清T水平方面疗效显著(P<0.01)。***及血糖、血脂指标:两组患者治疗后BMI、空腹葡萄糖、OGTT2h PG、总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇水平显著下降(P<0.05),黄连素组治疗后空腹胰岛素、OGTT2h INS、HOMA-IR指数均有明显改善(P<0.05)。***-3、TNF-α和IL-6:两组药物均可显著改善患者血清Gal-3、TNF-α和IL-6水平(P<0.05),且黄连素改善IL-6的效果明显优于二甲双胍(P<0.05)。***指标:两组间获卵数、受精率、新鲜周期取消率、临床妊娠率及早期流产率无统计学差异;二甲双胍组Gn用量更少,黄连素组患者的优胚率高于二甲双胍组。相关性分析:Gal-3水平与BMI、FPG、CHOL、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α、HOMA-IR、OGTT2h INS指标成正相关(P<0.05)。其中BMI、FPG、CHOL、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α指标与其关系更为密切;进行多重线性回归分析发现,Gal-3受TNF-α、BMI影响明显。结论:1.黄连素可以降低PCOS-IR患者的BMI、血糖、胰岛素、血脂水平,帮助患者减重、提高胰岛素敏感性,且改善胰岛素及HOMA-IR表现更佳,能够有效纠正代谢紊乱,改善IR状态。2.黄连素对PCOS-IR患者的血清LH、T水平有明显改善,尤其是降低T水平方面,较二甲双胍更具优势,能够有效提高卵子质量和优胚率,改善IVF助孕结局。3.黄连素与二甲双胍均可降低PCOS-IR血清Gal-3水平及相关炎症因子指标,缓解慢性炎症,从而达到改善IR状态的目的。

关键词： 黄曲霉素B1   适配体   DNA智能水凝胶   可视化检测   Capture-SELEX   杂色曲霉素  

摘要： 真菌毒素中毒性最强的黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)遍布于粮食生产、贮藏、运输和加工等各个环节,其污染已经成为全球亟待解决的问题。因此,对AFB进行现场化检测和防控显得尤为重要。AFB分子量低,无免疫原性,现场化免疫检测的抗体制备繁琐且批次间差异性大。作为新型识别元件的适配体其功能类似于抗体但明显优于抗体,具有制备方便、稳定性好、无批次间差异等特点。基于适配体构建的DNA智能水凝胶检测传感器,不仅具有水凝胶疏松多孔的特性,还具有特异性识别、高精度组装、易降解、成本效益高、便携和稳定等特点。然而AFB前体物质杂色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)作为AFB前置防控不可或缺的一部分,它的危害也不容忽视,但其适配体却鲜有报道。因此,本研究基于现有的AFB适配体构建了靶标响应DNA智能水凝胶检测传感器,并以ST为靶标,采用改进型Capture-SELEX技术,筛选获得一条高亲和力、高特异性的适配体H Seq02,并借助圆二色谱和分子模拟对接等技术研究了H Seq02和ST的结合机制,以期为黄曲霉毒素B进行现场化检测和防控提供参考。具体内容如下:***响应DNA智能水凝胶检测传感器:以DNA智能水凝胶为基底,AFB适配体为交联剂和识别元件,结合双重信号放大策略,构建了该传感器。当AFB存在时,会竞争性与其适配体结合,导致水凝胶裂解,辣根过氧化物酶(HRP)被释放,而外切酶Exo I的引入则实现了AFB的循环,促使水凝胶裂解的更彻底,释放更多的HRP,HRP催化TMB显色,最终以颜色和吸光值的变化,实现AFB可视化定量检测。结果表明,AFB浓度在0-500 n M区间内,溶液吸光值的变化与AFB的浓度具有良好的线性关系,检出限为4.93 n M(S/N=3)。该传感器可以应用于花生油样品中AFB的检测,检测结果与UPLC-HRMS检测结果基本一致。***适配体Capture-SELEX筛选:以链霉亲和素磁珠为文库固定载体,通过链霉亲和素和生物素的反应,将生物素标记的引物固定在链霉亲和素磁珠上;再通过碱基互补配对,将文库间接地固定到链霉亲和素磁珠上。参考ST半抗原的制备方法,将ST分子活化,增加其水溶性,制备高浓度靶标溶液,并将文库固定的磁珠投入其中孵育,使得对ST具有亲和力的ss DNA从磁珠表面解离进入溶液中,借助磁分离获得PCR模板进行扩增、长短链法制备单链,随后进入下一轮循环。在循环筛选过程中,通过减小文库投入量、降低靶标浓度、缩减正筛选时间、引入负筛选和反筛选等逐渐增强筛选的压力,并借助QPCR荧光扩增曲线对筛选进程进行监控,最终经过16轮的筛选,获得ST的富集文库。3.测序及分析:首先对测序结果进行同源性和相似性分析,初步选定8条适配体候选序列。采用逆向思维,通过构建适配体亲和柱(Aptamer affinity column,AAC),直接考察适配体的亲和性和特异性,结果显示适配体H Seq02的亲和性能最好,对20 ng ST的回收率可达99.2%;借助17种真菌毒素对基于H Seq02的AAC和市售的抗体亲和柱(Immunoaffinity column,IAC)特异性进行考察,结果表明AAC对除ST之外的16种毒素回收率均低于5%,而IAC对AFB、AFB、AFG、AFG、OTA和ST的回收率均高于90%,说明AAC的特异性较IAC好;2.3 nmol H Seq02构建的AAC容量可达82.4 ng。分子对接结果显示H Seq02与ST主要通过氢键结合,结合位点为H Seq02上的DA-29、DT-30、DT3-40碱基和ST分子上的羰基、羟基、甲氧基,而ST与AFT的分子结构差别主要在羰基、羟基上,这也印证了H Seq02对ST特异性识别较好的原因。

关键词： 小鼠   AFB1   肝脏损伤   PINK1/Parkin信号通路   线粒体自噬  

摘要： 黄曲霉毒素B(AFB)是毒性极强的真菌毒素,可造成人类和动物肝脏损伤。氧化应激是AFB致肝脏损伤的主要诱发因素,可导致肝脏线粒体损伤,受损的线粒体进一步触发NLRP3炎症小体过度活化,促进肝脏损伤。而线粒体自噬可特异性清除受损的线粒体,以抵御多种因素诱导的肝脏损伤,PINK1/Parkin途径是调控线粒体自噬的经典通路,但其在AFB致小鼠肝脏损伤中发挥何种作用尚无定论。因此,本研究以“PINK1/Parkin介导的线粒体自噬保护AFB致小鼠肝脏损伤”为理论假说,拟开展以下两方面的研究:(1)AFB亚慢性毒性试验:以C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠为受试对象,随机分为对照组(CG)、低剂量组(LG)、中剂量组(MG)和高剂量组(HG),连续28 d灌胃给予AFB,观测小鼠肝脏结构和功能、氧化应激状态、线粒体结构和功能、NLRP3炎症小体及线粒体自噬关键因子的表达,旨在明确线粒体自噬与AFB所致小鼠肝脏损伤的相关性,并筛选出Parkin基因敲除(Parkin)干预试验中AFB的适宜暴露剂量;(2)Parkin干预试验:以WT和Parkin的C57BL/6雄性小鼠为受试对象,将其分为WT对照组(WCG)、Parkin对照组(PCG)、WT AFB暴露组(WAG)和ParkinAFB暴露(PAG),连续28 d灌胃给予AFB,观测小鼠肝脏结构和功能、氧化应激状态、线粒体结构和功能、NLRP3炎症小体及线粒体自噬关键因子的表达,旨在探明PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在AFB致小鼠肝脏损伤中的作用。试验结果如下:(1)AFB亚慢性毒性试验结果:1)与CG相比,MG和HG小鼠精神沉郁,活动迟缓,体重增长抑制,表明AFB诱导小鼠生长抑制。2)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏重量及肝体系数显著降低,肝脏显微及超微结构损伤显著,血清中AST和ALT活性显著增高,表明AFB损伤小鼠肝脏结构及功能。3)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏ROS含量显著增高,SOD活性显著降低,表明AFB诱导小鼠肝脏氧化应激。4)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏超微结构中可见显著的线粒体结构损伤,肝脏ΔΨM及ATP含量显著降低,表明AFB可诱导小鼠肝脏线粒体结构和功能损伤。5)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、ASC、IL-18和IL-11β的蛋白表达均显著增高,表明AFB能够激活小鼠肝脏NLRP3炎症小体。6)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏PINK1、p-Parkin和LC3 II蛋白表达显著增强,p62蛋白表达显著减弱,表明AFB能够激活小鼠肝脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。7)MG和HG小鼠肝脏均显著受损,但MG肝脏线粒体自噬水平最高,故选择0.75mg/kg作为后续试验的AFB暴露剂量。(2)Parkin干预试验结果:1)与WAG相比,PAG小鼠精神抑制状态加重,反应更迟缓,体重增长抑制,表明Parkin可加剧小鼠生长抑制。2)与WAG相比,PAG小鼠肝脏重量及肝体系数降低,肝脏显微超微结构损伤加剧,血清中AST及ALT活性上升,表明Parkin可加重小鼠肝脏结构及功能损伤。3)与WAG相比,PAG小鼠肝脏ROS和MDA含量增高,SOD和GSH-Px活性降低,表明Parkin可加重小鼠肝脏氧化应激。4)与WAG相比,PAG小鼠肝脏超微结构中可见显著的线粒体结构损伤,肝脏ΔΨM及ATP含量降低,表明Parkin可加重小鼠肝脏线粒体结构和功能损伤。5)与WAG相比,PAG小鼠肝脏NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、ASC、IL-18和IL-11β蛋白表达增高,表明Parkin可加剧小鼠肝脏NLRP3炎症小体活化。6)与WAG相比,PAG小鼠肝脏PINK1和LC3 II蛋白表达下降,p62蛋白表达升高,说明Parkin抑制小鼠肝脏线粒体自噬。结论:AFB暴露可激活肝脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,其在AFB致小鼠肝脏损伤中发挥保护作用,该保护作用与清除肝脏受损的线粒体,抑制氧化应激和NLRP3炎症小体活化有关。

关键词： 黄曲霉毒素B1   神经行为   斑马鱼   脑组织   脂质组学  

摘要： 黄曲霉毒素污染一直是全球范围内重点关注的问题,其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)污染频率高且毒性极强。近年研究发现黄曲霉毒素对脑组织的结构和功能具有严重的破坏作用。但目前其针对脑组织产生的具体毒性效应及机制尚不清楚。因此本研究以成年斑马鱼为研究对象,开发一种脂质组学方法,探究由于AFB1带来的脑组织中脂质代谢紊乱,并揭示其对代谢途径的影响和意义,这也为药物治疗提供了依据,主要研究内容及结果如下:1.对斑马鱼进行了连续7天的暴露,暴露分为三个浓度:空白对照组、低浓度组(5μg/L)和高浓度组(20μg/L)。暴露结束后,对脑组织中AFB1进行定性定量分析,结果发现低、高浓度暴露组的脑组织中均有AFB1检出,分别为1.558±0.142μg/kg和2.420±0.266μg/kg。2.通过行为分析测定了AFB1对斑马鱼运动行为的影响,发现低浓度AFB1显著促进斑马鱼运动,高浓度AFB1则对其运动行为有抑制作用。斑马鱼的运动轨迹呈现出边缘化趋势,且随着暴露浓度增加,边缘化现象趋于严重。3.建立了一种基于Waters Synapt离子淌度飞行时间质谱(UPLC-IM-TOF-MS)的脂质组学分析方法,通过与自建库进行匹配,该分析方法从斑马鱼脑组织中鉴定得到1734种脂类化合物,共计87个亚类。4.通过对AFB1暴露后斑马鱼的脑组织进行脂质组学分析,获得产生差异的114个脂质,观察到包括脂肪酸(FA)、甘油脂(GL)、甘油磷脂(GP)和鞘脂(SP)在内的显著代谢变化,主要涉及鞘脂代谢和脂肪酸降解两条代谢途径,可能是神经行为变化的原因之一。神经酰胺(Cer)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、甘油三酯(TG)、脂肪酸酰胺及其类似物等脂质可能成为AFB1诱导的代谢功能障碍的潜在脂质生物标志物。根据上述研究,本文结合短期低剂量AFB1暴露后斑马鱼的运动行为变化,通过UPLC-IM-TOF-MS和化学计量学方法结合分析,描述了由AFB1引起的脂质代谢紊乱,揭示了神经行为异常与脂质代谢紊乱之间的潜在联系。有望为AFB1引起的病因排查、早期诊断、精准治疗提供参考。

关键词： 沸石   氧化石墨烯   金属离子   黄曲霉毒素B1   复合改性  

摘要： 黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒代谢产物,它可通过食物链进入动物体和人体内,具有蓄积毒性,尤其是肝脏蓄积毒性。长期食用含有黄曲霉毒素的食物,会引起肝损伤和肝癌等疾病。黄曲霉毒素B(AFB)是黄曲霉毒素中最强的一种,对其吸附方法和吸附性能的研究有重要的意义。本文用改进的Hummers法制备氧化石墨烯(GO),选取不同的金属离子(Ca、Cu、Fe和Zn)作为配位阳离子,制备了氧化石墨烯/金属离子复合改性沸石,筛选出对AFB吸附量最大的氧化石墨烯/钙离子复合改性沸石(GO-Ca-Z),改变GO和Ca的投入量制备出不同比例的GO-Ca-Z(2:1、1:1和1:2),对其进行结构表征及吸附性能的研究。结果表明:GO-Ca-Z具有更大的比表面积、总孔体积及丰富的官能团,有利于吸附性能提高;GO-Ca-Z(2:1)在浓度为2 mg/m L、AFB初始浓度为0.5 mg/L、吸附温度为25℃时吸附量最高为0.243 mg/g;在不同AFB初始浓度下,吸附反应均在360 min时达到吸附平衡,并且吸附量均随着AFB初始浓度的增加而增加,随吸附反应温度升高而减小,说明升高温度不利于反应进行。用NaOH溶液改性天然沸石,通过响应面实验优化制备条件,再对其进行结构表征与吸附性能研究。结果表明:最优制备条件为Na OH浓度4.96M、反应温度114.8℃、反应时间5.28 h;Na OH改性沸石孔道结构更加明显,呈现出类似于珊瑚礁状的结构,这是由于Na OH溶液脱除了沸石表面的硅,同时去除了原本附着在沸石内部的结合水和杂质,增大了比表面积和总孔体积;在最优Na OH改性天然沸石浓度为2 mg/m L、AFB初始浓度为0.5 mg/L、吸附温度为25℃时,吸附量达到0.187 mg/g;在不同AFB初始浓度下,吸附反应均在720 min时达到吸附平衡,并且吸附量随着AFB初始浓度的增加而增加,随吸附反应温度的升高而增大,说明升高温度有利于反应进行。将以上两种复合材料吸附AFB的数据进行了拟合,GO-Ca-Z(2:1、1:1和1:2)和最优条件Na OH改性天然沸石的吸附过程均符合动力学模型中的准二级动力学模型,表明以化学吸附为主;在等温模型中更符合Freundlich模型,表明是多层吸附。该论文有图25幅,表24个,参考文献87篇。