关键词： AFB1   基因挖掘   脱毒酶   基因表达   毕赤酵母   降解产物   毒性分析  

摘要： 黄曲霉毒素(AFT)是由曲霉属真菌在高温高湿条件下产生的一类致癌性真菌毒素,广泛分布于自然界。其中黄曲霉毒素B(AFB)被认为是最常见和最有害的AFT,对哺乳动物和家禽有致癌性、DNA突变、免疫毒性和肝毒性等毒性作用。花生、玉米、棉花和辣椒等不同农作物在生长、存储和加工时极易受到AFB的污染,并通过食品和农副产品对人类和动物的健康带来严重威胁,并且给世界经济造成了数十亿美元的损失。目前已经报道了多种去除AFB的策略,大致可以分为物理法、化学法和生物法。生物法因其温和的降解条件,对农作物营养价值的影响最小,被认为是最具有潜力的解毒方法。本研究基于Pac Bio测序平台,对实验室早期筛选的AFB高效降解菌土曲霉(Aspergillus terrus)HNGD-TM15进行全基因组测序和组装,系统分析挖掘其降解AFB的基因,并在大肠杆菌和毕赤酵母中实现异源表达,扩展黄曲霉毒素微生物降解资源库。并且探究重组菌对AFB的降解机理,以及降解产物的肝毒性和致突变作用。具体研究总结如下:1.首先,对实验室前期筛选得到的AFB降解菌土曲霉HNGD-TM15进行了三代全基因组测序,得到了该菌株的编码基因及蛋白序列,并对其基因与常用数据库进行BLAST比对和注释。全基因测序结果显示:该菌株总基因大小34.39 Mbp,总长度为24,983,996 bp,序列GC含量为52.23%。此外,利用BLASTp方法与报道过的AFB降解酶基因进行比对,以及基因功能注释筛选,共得到5个AFB降解酶基因。2.对挖掘得到的所有基因进行扩增、载体构建以及在大肠杆菌中表达和纯化,对纯化的酶液进行AFB降解功能验证。通过提取土曲霉RNA,反转录得到的c DNA为模板,PCR扩增得到了所有候选基因,并对基因进行回收和纯化。纯化后的基因浓度分别为87.0、84.2、98.2、107.3和93.1 ng/μL,提取p ET-28a载体的质粒浓度为179.3 ng/μL。以p ET-28a为表达载体,通过同源重组的方式将5个候选基因与p ET-28a连接,经过质粒PCR、双酶切、测序等方式验证,成功构建表达载体。将构建好的带有候选基因的质粒分别转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,经过IPTG诱导,成功表达四个候选基因。其中重组FET3、DDP3、和Cpo P酶为包涵体表达,分子量大小分别为65、36和36 k Da。重组Frs A酶为可溶性表达,分子量大小为32 k Da。重组Frs A酶为可溶性表达,分子量大小为32 k Da。将纯化的重组蛋白与AFB混合,FET3、DDP3、Frs A和Cpo P对AFB的降解率分别为8.6%、55.18%、20.58%和11.6%,在介质存在的情况下,FET3的降解率也只有21.45%。3.将验证得到的降解酶基因DDP3在毕赤酵母中异源表达,并命名为ATADE。首先将ATADE基因序列进行密码子优化,优化后序列GC含量由53.93%降至41%,密码子适应指数(CAI)由0.68升至0.94。采取同源重组技术,选择p PIC9K-6His作为异源表达ATADE的真核表达载体,将优化的ATADE基因与所选载体相连,得到了重组表达载体p PIC9K-His-ATADE,将构建好的重组质粒电转化入毕赤酵母GS115,构建成重组菌GS115(p PIC9K-His-ATADE)。由于p PIC9K-His是分泌表达载体,对发酵上清液进行分离纯化,得到了目的蛋白,经SDS-PAGE电泳条带显示,分子量大小为36 k Da,并且酶活检测结果表明重组蛋白具有AFB降解酶的活性。此外,对重组菌GS115的小型摇瓶发酵条件经优化,小型摇瓶发酵条件经优化得到的最佳诱导条件为:接种量为2.5%,保持甲醇浓度为4%,在30℃的诱导温度下诱导72 h。通过不同p H以及温度下重组ATADE对AFB的降解发现,该酶对p H敏感,且在碱性条件下降解率更高。此外,在温度30℃～40℃时更适合AFB降解。4.对降解酶的降解产物进行检测,得到降解产物的结构以及推测降解路径,并通过斑马鱼实验和Ames实验证明降解产物的毒性和致突变性作用。通过UPLC-MS检测,根据测定的母体离子和碎片质量,以及AFB的标准分子量,我们确定了AFB和四个可能的降解产物,这些组分的m/z分别为299.0914(CHO)、343.0812(CHO)、287.0914(CHO)、375.1074(CHO)。根据产物的二级质谱碎片图谱及相关文献,得到了降解产物的分子结构,通过对产物的结构推测降解产物的生成途径,主要是内酯环断裂以及呋喃环的取代反应。此外,通过斑马鱼实验和Ames实验对降解产物的肝毒性和致突变性进行评估。结果表明,当降解产物处理斑马鱼幼鱼96 hpf时,斑马鱼存活率为100%,没有出现肝脏

关键词： 金属有机骨架材料   Fe-金属有机凝胶材料   纳米酶   传感平台   黄曲霉毒素B1   多巴胺   敌百虫  

摘要： 食品中真菌毒素、农药残留带来的生物及环境危害不容忽视,因此开发快速灵敏检测真菌毒素、农药残留的分析方法具有重要意义。基于金属有机骨架(MOF)及凝胶(MOG)材料的传感平台具有灵敏、耗时短等优点,被广泛用于食品毒素与农残的检测。本文合成了Fe MOG以及具有纳米酶性质的Mn MOF、Mn-ZIF-67-0.4、TCPP-Cu CoO,将其用于构建真菌毒素和农药残留检测的传感平台。本文的研究工作分为以下四个部分:(1)黄曲霉素B1(AFB1)是天然食品中最为常见的一类污染物,其毒性和致癌性也最强。本实验合成了具有类过氧化氢酶性质的金属有机骨架材料Mn MOF纳米酶,经高温炭化后得到Mn MOF-C,通过掺杂铂纳米颗粒得到复合材料Pt NPs@Mn MOF-C,发现其催化能力可进一步增强。将该复合材料作为标记物用于制备AFB1适体传感器,利用适体的高度亲和力与高特异性,使其与AFB1发生特异性结合从电极表面解离下来,导致Pt NPs@Mn MOF-C催化过氧化氢产生的电流信号减小,从而实现食品中AFB1的定量检测。在0.001～100 ng/m L范围内,随着目标物AFB1浓度的增大,响应信号逐渐降低。本实验所构建的适体传感器灵敏度高、耗费时间短,可用于真实大米样品中AFB1的检测,展现出良好的应用前景。(2)采用一锅法制备了双金属有机骨架材料Mn-ZIF-67-0.4,利用其优异的类氧化酶性质构建了比色传感平台用于多巴胺(DA)的检测。在最优条件下响应信号(652 nm处的吸光度差值)与DA浓度具有良好的线性关系,线性范围为0.4-80μmol/L,R=0.9952,回归方程为ΔA=0.0145 c+0.1303。本实验所构建的DA比色传感平台可用于人血清中DA的检测,具有成本低、耗时短、检测灵敏等特点。(3)利用新型金属有机凝胶Fe MOG构建乙酰胆碱酯酶(ACh E)传感器。Fe MOG具有较好的导电性,通过900℃热处理后得到Fe MOG-N-C,其电阻值可进一步减小。使用Au NPs@Fe MOG-N-C作为基底导电材料将ACh E固定到电极上,ACh E可催化氯化乙酰硫代胆碱(ATCh)水解生成具有还原性的硫代胆碱(TCh),TCh在0.6 V处具有特征的氧化峰。而农药可抑制ACh E的活性,从而抑制TCh的生成,导致氧化峰电流减小,由此可实现对农药的灵敏检测。(4)利用5,10,15,20-四羧基苯基卟啉(TCPP)对Cu CoO进行功能化,得到了具有优异类过氧化物酶性能的TCPP-Cu CoO,将其用于敌百虫比色传感平台的构建。在HO存在时,TCPP-Cu CoO可以将无色3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色ox TMB,伴随652 nm处较强的吸收峰出现,而ACh E可将ATCh特异性水解成TCh,TCh具有巯基结构,可以还原ox TMB,使得652 nm处的吸收峰降低。而敌百虫能不可逆抑制ACh E的活性,使得吸收峰恢复,以此构建比色传感平台用于ACh E活性和敌百虫的检测。该方法具有检测快速、成本低廉、操作简单等优点。实验所提出传感平台对敌百虫具有40-4000 ng/m L的宽线性检测范围,线性相关系数为0.9904。此外,当乙酰胆碱酯酶在0.1-5 U/L活度范围内,该平台的响应信号(652 nm处的吸光度差值)与ACh E活度呈现出良好的线性关系。本实验所提出的检测方法可应用于蔬菜中敌百虫的检测,具有良好的应用前景。

关键词： 中药制剂   糖尿病肾病   网络药理学   HK-2   肾小管间质纤维化  

摘要： 目的:本研究旨在基于网络药理学联合体外细胞实验探讨益气活血中药制剂大株红景天注射液干预TGF-β1诱导的近端肾小管细胞异常迁移及表型转变的机制研究,以期为HJT治疗TIF的临床应用提供新的思路和途径。方法:一、网络药理学的方法分析HJT干预TGF-β1诱导的HK-2细胞的活性成分、通路和靶点。使用中药系统药理学(TCMSP)数据库筛选从文献中获得的HJT活性成分,并使用Chemmapper、SEA和Swiss靶标预测数据库筛选活性成分的靶点。随后用过Cytoscape3.7.2软件建立“HJT活性成分-靶点”网络。此外,从GEO数据库中查找TIF相关芯片,获得TIF疾病相关靶点。用火山图对差异基因可视化。再通过Jvenn工具对HJT活性化合物调控的基因和TIF的差异基因进行了取交集得出交叉靶点。将得到的基因靶点输入STRING在线平台进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的建立,通过京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析确定信号通路和关键靶点。二、体外细胞实验以HK-2细胞为研究对象,用CCK-8法检测HJT对细胞的毒性并筛选合适浓度。使用实时荧光定量PCR检测TGF-β1和HJT对关键基因表达的影响并确定TGF-β1实验浓度。使用Western Blot法进一步验证HJT对关键基因SPHK1表达的影响。通过伤口愈合实验和transwell实验检测HK-2细胞迁移情况,通过免疫荧光实验检测HK-2细胞中Vimentin和Cytokeratin-18的表达情况。结果:一、网络药理学分析结果表明,HJT中有36个活性化合物,其中主要核心成分包括对香豆素酸和没食子酸乙酯等。HJT活性成分共含有1044个预测靶点,通过构建韦恩图得到与TIF的差异基因的重叠基因功能79个。通过构建PPI网络,筛选得到了共25个核心基因。KEGG通路分析发现在HJT对TIF的治疗中,代谢途径是其最重要的通路,25个核心基因中的GAD1、SPHK1、P4HA2、AKR1B1和PTGES在代谢途径中富集。二、在体外诱导的细胞模型实验中,我们验证了TGF-β1对HK-2细胞中AKR1B1、GAD1、P4HA2、SPHK1和PTGES表达的影响,与GEO芯片中趋势相符,且HJT可以显著恢复TGF-β1诱导的HK-2细胞中SPHK1的表达。伤口愈合实验和transwell实验结果表明HJT抑制了TGF-β1诱导的HK-2细胞的异常迁移;免疫荧光实验结果发现TGF-β1上调了Vimentin的表达而下调Cytokeratin-18的表达。相反,在HJT干预后Vimentin和Cytokeratin-18的表达被逆转。结论:本研究全面阐述了益气活血中药制剂HJT抗TIF的活性化合物、潜在靶点和分子机制。HJT可能是通过靶向SPHK1逆转TGF-β1引起的异常迁移及表型转变治疗TIF。

关键词： 黄曲霉毒素B1   芳香烃受体   结肠炎   巨噬细胞   线粒体ROS  

摘要： 研究目的黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是最常见、毒性最大的一种真菌毒素,广泛存在于谷物及其食品制品中。由于其高度的化学和热稳定性,即使食品加工后也很难完全消除,是动物及人类健康潜在的危险因素。AFB1具有致癌性、致突变性、致畸性和免疫抑制作用,对肝脏、肾脏、神经系统均具有毒性作用,大量的研究对其相关毒性机制进行了探讨。近年来的研究显示低剂量AFB1亚急性暴露与肠道炎性损伤相关,但其机制尚不明确。新近研究表明,AFB1是芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AHR)的配体,其结合活性得到了鉴定和确认。配体-受体结合是细胞敏感且有效的应答外界刺激的启动机制,AHR被认为可通过靶向炎性相关基因表达、调控免疫细胞分化影响免疫或炎性疾病的发生发展。因此,我们推测AHR可能参与介导了AFB1对肠道的炎性损伤效应。为进一步观察和确认AFB1与肠道炎性损伤及与AHR的关系,本研究观察了 AFB1亚急性暴露对小鼠结肠组织的损伤效应及与肠道组织内巨噬细胞的关系;采用体外实验进一步探索了 AFB1通过影响巨噬细胞功能损伤肠上皮细胞的潜在机制,并经多组学技术联合应用分析了 AFB1诱导的巨噬细胞AHR/TLR/STAT3相关信号轴改变与小鼠结肠炎间的相关性,以有助于AFB1及其它环境污染物致结肠炎的有效防治。研究方法体内实验中,BALB/c雄性小鼠经口染毒AFB1 30d,通过血常规及血清炎性脂质组学检测评价体内炎性状态,结肠组织切片病理形态学观察评估AFB1对小鼠结肠的损伤,HE染色观察炎性细胞浸润并采用免疫荧光染色观察髓系来源的免疫细胞在肠道损伤部位的聚集情况。体外实验中,将人单核细胞白血病(THP-1)细胞首先诱导分化为巨噬细胞(M0)后给予AFB1暴露,采用Transwell与人结直肠腺癌(Caco-2)细胞进行共培养,观察AFB1经巨噬细胞介导对肠道上皮细胞的损伤作用;并进一步通过Western blot、多组学等多种技术手段分析AFB1对THP-1诱导分化的M0型巨噬细胞的影响及相关蛋白改变,探究AHR/TLR/STAT信号轴在AFB1诱导结肠损伤中的机制作用。实验结果体内实验结果表明,AFB1(5～50μg/***)经口暴露小鼠导致小鼠肠道长度缩短、结肠隐窝模糊甚至消失、杯状细胞黏蛋白分泌增多、上皮细胞损伤,伴有明显的炎性细胞浸润;血清炎性脂质组学检测显示与炎症反应相关分子发生明显变化;小鼠结肠组织中活性氧(reactive oxygen species,ROS)及一氧化氮(nitric oxide,NO)呈现剂量依赖性升高;免疫荧光染色可见明显的髓系免疫细胞聚集和浸润。体外实验结果表明,AFB1暴露导致THP-1诱导分化的M0巨噬细胞吞噬能力增强,伴随 ROS、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)水平明显升高。将THP-1诱导分化的M0型巨噬细胞经AFB1暴露后与Caco-2细胞共培养,采用7-AAD/Annexin V染色经流式细胞术检测显示AFB1引起Caco-2细胞死亡增加,同时升高培养基中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factors-α,TNF-α)及白介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。转录组测序(RNA-seq)及蛋白质组学分析显示,巨噬细胞暴露于AFB1后,炎性通路相关mRNA及蛋白发生明显改变;Western blot检测进一步证实AFB1暴露诱导巨噬细胞炎症相关功能蛋白表达呈现显著上升趋势,AHR及AHR/TLR/STAT3信号轴关键蛋白变化显著。结论***1亚急性暴露导致BALB/c小鼠结肠炎,表现为小鼠肠道长度缩短、结肠隐窝模糊、杯状细胞和上皮细胞受损,伴随明显的炎性细胞浸润。***1可通过AHR/TLR/STAT信号轴,上调M0巨噬细胞AHR、TLR2、TLR4蛋白表达,下调线粒体ROS调节因子STAT3和p-STAT3(Ser727)的表达,使其处于炎性状态,导致肠道上皮损伤。

关键词： 3菌培养物   中药制剂   断奶仔猪   血清生化指标  

摘要： 该试验探讨了3菌培养物、中药制剂和3菌中药合剂对提高断奶仔猪的抗氧化、抗应激能力和增强其免疫力作用的影响。从35日龄的健康无疾病的三元杂交(杜×长×白)断奶仔猪中抽取80头，保证仔猪性别比例一致，以随机分组原则为标准，将仔猪分为4组，每组按每个重复数5头设定为4个重复。以基础日粮饲喂对照组，基础日粮添加0.5%3菌培养物饲养A组，基础日粮添加0.5%中药制剂饲养B组，加入0.5%3菌中药合剂的基础日粮饲喂C组。预试期5 d;试验期42 d。结果表明：1)各个试验组均能提高断奶仔猪抗应激及抗氧化水平，并且C组表现尤为显著；2) 3试验组免疫球蛋白G(IgG)的含量均明显增加，而C组更为显著；3)血清生物学指标的测试均优于对照组，C组在血清尿素(P<0.05)、碱性磷酸酶(P<0.05)和谷丙转氨酶(P<0.05)等活性上均表现出显著的优势。因此，3种添加剂饲喂仔猪对其血清指标均有促进作用，3菌中药合剂的效果最为突出。

关键词： 黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   产酶溶杆菌SR02   生物降解   降解特性  

摘要： 黄曲霉毒素B（Aflatoxin B,AFB）作为毒性最强的生物毒素之一,可在人或动物体内蓄积,具有致畸、致癌及致突变等危害;玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种污染广泛的霉菌毒素,广泛分布在玉米、小麦以及一些农副产品中,具有类雌激素作用,两种毒素严重危及人类的健康安全。目前关于这两种毒素的脱毒方法主要包括物理法、化学法和生物法,生物法脱毒具有高效、绿色、安全等特点,是目前真菌毒素去除的主要方法。本文筛选得到一株对黄曲霉具有拮抗活性菌株并能高效降解AFB和ZEN,对其进行分子鉴定、形态学分析以及胞外水解酶活性测试;研究其生长特性以及对AFB和ZEN的降解活性,分别对其降解组分进行定位,探究温度、p H、金属离子、蛋白酶K对其稳定性的影响,分析降解产物可能的结构以及对降解途径的推导。主要试验结果如下:（1）从福建省闽侯县溪源江旁苋菜根际土壤中分离筛选得到一株具有拮抗黄曲霉活性的菌株且拮抗活性物质来源于胞外,同时发酵液对被黄曲霉感染花生具有保护作用;经16S r DNA测序分析该菌株为产酶溶杆菌,将其命名为产酶溶杆菌SR02;观察在6种培养基中的菌落均表面湿润有光泽。菌株在LA培养基上能够产生胞外葡聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶和纤维素酶。菌株SR02对5μg/m L AFB的去除率72h达94.02%,溶杆菌对AFB的降解未见报道。（2）产酶溶杆菌SR02发酵上清液、菌体、胞内组分对AFB降解率分别为91.35%,15.45%,9.71%;同时上清液对AFB的降解性能不受蛋白酶K及高温的影响,且主要活性成分小于3 k Da,证明上清液中起主要降解作用的活性物质并非酶或蛋白,可能是氧化小分子物质。随后研究发酵上清液降解AFB的最适反应条件;3%甲醇开始抑制菌株SR02在LB培养基中的生长;5μg/m L AFB对菌株的生长没有影响;10 m M Ca、Mg、Cu、Fe、Zn、Mn能够不同程度的抑制SR02发酵上清对AFB的降解性能;p H在5.0～9.0范围内有良好的降解作用,降解率随p H值的增加而增加,在p H 9.0时降解率最高（92.41%）,而在p H 5.0去除率仅为55.19%。50%乙腈可以将少量AFB降解产物提取出来,HPLC检测出3个差异峰;LC-MS检测到降解产物的质子化加合物[M+H]分别为:m/z 186.13、m/z 301.00、m/z 330.24;因降解产物含量较低,在实验室条件下未能对其进行分离鉴定。在胞外组分检测到HO、OH、O的产生,其中O的产生由还原型辅酶Ⅰ或Ⅱ所致。OH、O能够不同程度的降解AFB,因此推测AFB的降解可能是由于胞外产生的OH、O所导致并推导其可能的降解途径。（3）产酶溶杆菌SR02能够高效的生物转化ZEN,上清液、细胞、胞内组分对ZEN的降解率分别为7.55%、79.58%和2.95%,细胞起主要的降解作用,灭活的细胞对ZEN失去转化作用;p H为7.0时有最大的转化率;同时菌株适应广范围的转化温度,30℃时转化率为95.71%。HPLC检测到转化产物ZEN-P的产生,且出峰时间较ZEN标准品提前了0.947 min,推测产物极性大于ZEN本身;通过HPLC制备出转化产物ZEN-P,其UV-Vis光谱与ZEN基本一致,LC-MS检测到降解产物的质子化加合物[M+H]为:m/z 320.47,与目前报道的α-ZOL,β-ZOL的UV-Vis光谱和质子化加合物[M+H]基本一致,通过HPLC比较了ZEN-P与α-ZOL的出峰时间与UV-Vis光谱,确定了产酶溶杆菌SR02将ZEN转化为α-ZOL。本文首次报道溶杆菌能够高效降解AFB和ZEN,对其降解特性以及活性成分定位的研究为今后AFB和ZEN的脱毒提供理论参考。

关键词： 黄曲霉毒素B1   胶体金试纸   枯草芽孢杆菌   脱毒处理  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）是一种真菌毒素，普遍存在于农产品中，每年给食品工业和畜牧业带来巨大的经济损失。长期接触AFB1会造成免疫系统功能障碍、生长障碍和生殖功能下降。因此，迫切需要建立饲料中简便有效，适用于大批量现场检测AFB1的方法，经过检测后，对超标的饲料进行脱毒处理，减少畜牧业的损失。目前生物降解AFB1的方法因其高效、温和、无毒害残留等优点已经成为研究热点。本研究通过改变AFB1的结构制备人工抗原，通过免疫剂量、免疫间隔的选择制备了抗AFB1单克隆抗体，研制了胶体金免疫层析试纸，筛选出能够高效降解AFB1的菌株，初步研究了菌株的降解机理，通过对饲料进行检测，确定其AFB1的含量，进而对其进行降解。研究内容如下：　　（1）本研究根据AFB1的分子结构和活性位点，采用肟化活泼酯法（Oximationactiveester，OAE）引入羧基，生成AFB1肟（AflatoxinB1oxime，AFB1O），在碳二亚胺（1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide，EDC）的作用下与载体蛋白牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin，BSA）和卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）偶联，分别制备出人工免疫原AFB1-BSA和包被抗原AFB1-OVA，经过紫外（Ultraviolet，UV）鉴定、蛋白质凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）鉴定，结果表明，免疫原AFB1-BSA制备成功，其分子结合比为9.21∶1。通过免疫Balb/C小鼠获得AFB1多克隆抗体（Polyclonalantibody，pAb），用间接非竞争酶联免疫吸附试验（Indirectnon-competitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay，inELISA）测定血清AFB1pAb效价，间接竞争ELISA（IndirectcompetitiveELISA，icELISA）测定AFB1pAb的特异性和敏感性，结果表明，免疫的4只小鼠的AFB1pAb效价均达到1∶1.28×104，并且对AFB1有较强的特异性和较高的敏感性，为下一步单克隆抗体的制备奠定了基础。　　（2）对小鼠脾细胞和NS0骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过3次亚克隆，筛选出3株效价高、灵敏度好的单克隆杂交瘤细胞株1G4、3F8和4B6，选择其中效价最高，灵敏度最好，能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株1G4建立杂交瘤细胞系，用体内诱生腹水法制备AFB1单克隆抗体（Monoclonalantibody，mAb），用饱和硫酸盐沉淀法纯化AFB1mAb。用inELISA测定细胞培养上清和腹水AFB1mAb效价，icELISA测定其50%抑制浓度（50%inhibitionconcentration，IC50），交叉反应试验（Crossreaction，CR）测定其特异性，结果表明，AFB1mAb的腹水效价可到1∶5.12×105，IgG亚型为IgG2a+κ链，亲和常数（Affinityconstant，Ka）为2.08×108L/mol，对AFB1的IC50为0.203μg/L，与AFB2、AFG1、AFG2的CR分别为53.2%，22.9%和20.5%，与其他霉菌毒素无CR，能够特异性识别AFB1，为下一步建立AFB1的高灵敏度检测方法提供了核心试剂。　　（3）利用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金溶液，利用胶体金标记所制备的抗体，建立AFB1胶体金免疫层析试纸的检测方法。通过Mey氏稳定法试验，确定抗体偶联胶体金的最适pH和浓度为6.8和18μg/mL，通过优化检测线（Testline，T）T线和质控线（Controlline，C）C线的最佳包被浓度，将1.2mg/mLAFB1-BSA和0.8mg/mL山羊抗小鼠IgG（Goatanti-mouseIgG，GaMIgG）包被在硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜上。对试纸条的材料进行筛选和预处理后进行组装，其对AFB1的最低检测限为1ng/mL，能够特异性地识别AFB1，与其他霉菌毒素无CR。对89份饲料样本的检测结果表明，与液相色谱-质谱联用（Liquidchromatography-massspectrometrycoupling，LC-MS）检测结果的符合率达到97.8%，所研制的AFB1试纸的检测结果是可靠的，可用于食品和饲料中AFB1的污染检测。　　（4）本研究在新乡市动物园采集27个动物粪便与土壤样品，以香豆素为唯一的碳源进行筛选，筛选出6株可以在香豆素初筛培养基上稳定生长的菌株。经过对AFB1的降解试验，H17的降解率最高为96.2%

关键词： 黄曲霉毒素B1   黄曲霉毒素M1   膳食暴露   风险评估   疾病负担   伤残调整寿命年  

摘要： 研究目的黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的有毒次级代谢产物,可污染多种农产品,威胁食品安全。AF毒性的大小随结构或种类的不同存在较大的差异,其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的毒性最大,致癌性最强,其次为黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)。研究发现长期AF暴露会增加肝癌发生风险,特别是对于患有慢性乙型肝炎的人群,严重影响人体健康。山东省作为农业大省,农产品中AF的污染水平对维持人群健康至关重要。因此,本研究通过分析山东省主要食品中AFB1和AFM1污染状况,结合居民食品消费量计算山东省居民膳食暴露于AFB1和AFM1导致的健康风险,以及评估采取AF防控措施降低疾病负担的效果,为食品安全部门采取风险管理措施提供科学依据。研究方法本研究从山东省16个地级市采集玉米及其制品270份、小麦及其制品1015份、大米103份、花生及其制品166份、其他熟制坚果466份、花生油80份、玉米油125份、其他植物油(除花生油和玉米油)209份、调味品216份、婴幼儿谷类辅助食品89份和乳及乳制品645份,共计3384份。对采集的样本采用免疫亲和层析-高效液相色谱法进行检测。通过点评估法对山东省食品中AFB1和AFM1进行膳食暴露风险评估;通过肝癌发病风险法、暴露限值法(margin of exposure,MOE)和危险指数法(hazard index,HI)评估山东省居民膳食暴露于AFB1和AFM1导致的致癌风险和非致癌风险;通过儿童发育迟缓的风险评估了解AFM1暴露对儿童年龄别身高Z评分(height-for-age z-score,HAZ)的影响;通过伤残调整寿命年(disability adjusted life year,DALY)评价AFB1和AFM1防控措施降低疾病负担的效果。研究结果1.山东省主要食品中AFB1总阳性率为6.50%(178/2739),总不合格率为0.95%(26/2739)。花生油中AFB1污染水平最高,AFB1样本阳性率为26.25%(21/80),含量均值为9.33μg/kg,最大值为274.00μg/kg,其中散装花生油中AFB1的污染水平远高于预包装花生油,差异具有统计学意义(P<0.05)。农村居民AFB1总暴露量高于城市居民。2～6岁年龄组人群通过食用花生油暴露于AFB1导致的健康风险最高,其MOE值小于10000,一般人群和消费人群肝癌发病风险分别为0.0846例和0.3512例/10万人。严格执行限量标准后,在食用花生油的一般人群和消费人群中,由于AFB1暴露导致的肝癌疾病负担分别降低3928和18600;针对AFB1采取的不同防控措施每年可减少的DALYs 为 232-20580。2.山东省乳及乳制品中AFM1总阳性率为4.03%(26/645),总不合格率为0。婴幼儿配方奶粉中AFM1污染水平最高,其样本阳性率为11.51%(16/139),最大值为0.19μg/kg。2～3岁年龄组暴露于AFM1产生的致癌风险最高,肝癌发病风险为0.0025例/10万人。2～3岁消费人群通过食用液态乳和婴幼儿配方奶粉可能会导致非致癌风险以及发育迟缓风险。AFM1防控措施有助于每年减少的DALYs为6.21-11.58。研究结论1.山东省花生油中AFB1污染水平最高,散装花生油中AFB1污染水平高于预包装花生油。乳及乳制品中婴幼儿配方奶粉的AFM1污染水平最高,冬季乳制品中AFM1浓度高于其他季节。2.农村居民的AFB1总暴露量高于城市居民;2～6岁年龄组儿童暴露于AFB1导致的健康风险最高;2～3岁年龄组儿童通过食用液态乳和婴幼儿配方奶粉暴露于AFM1可能会导致非致癌风险;儿童早期接触AFM1可能与发育迟缓有关。应对2～6岁年龄组的儿童予以重点关注。***1防控措施以及严格执行限量标准可以有效降低人群的肝癌疾病负担;AFM1防控措施对于降低人群的肝癌疾病负担影响较小。

关键词： 中药制剂技术   课程思政   教学改革  

摘要： 笔者以课程思政为引领,对高职高专《中药制剂技术》课程项目教学法的构建进行初步探讨总结,从而促进知识传授、能力培养与社会主义核心价值观的有机融合,使课程思政教育过程变得生动起来,潜移默化地影响学生,实现立德树人的人才培养目标。

摘要： 目前临床治疗疾病的主要方式之一是药物治疗，无论是轻度发热、咳嗽等症状，还是术后、疾病恢复期等阶段均需给予药物进行辅助治疗[1]。随着我国医药事业逐步发展，临床药物种类也日益增多。主治医师在开具药方时，需谨慎了解其症状、表现、体征指标等，并熟练掌握药物成分、药物作用机理、用药时机、用药剂量、药物不良反应、监测方式等。