关键词： 核酸适配体传感器   置换型荧光探针   硫磺素T   赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   腺苷  

摘要： 利用硫磺素T(ThT)作为置换型荧光探针，分别构建了3种核酸适配体生物传感器，用于赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)和腺苷(Adenosine)3种生物小分子的快速检测。当靶标分子不存在时，ThT与核酸适配体结合形成复合物，具有较强的荧光响应；加入靶标分子后，ThT的荧光强度减弱，通过监测荧光信号的变化实现对靶标分子的定量检测。详细探究了检测机理，圆二色光谱分析结果表明，加入ThT和靶标分子后，核酸适配体的构象没有明显变化，只是此构象比例增加，因此系统的荧光强度的降低并非由于靶标诱导核酸适配体结构变化，而是因为分子置换作用所致；通过等摩尔连续变化法测定ThT与OTA、AFB1、腺苷的核酸适配体的化学计量比分别为1∶1、1∶1和2∶1，并且解离常数均大于靶标分子与核酸适配体的解离常数。因此，本方法的检测原理是靶标分子置换与核酸适配体结合的荧光探针(ThT)，通过测定被靶标分子置换出的ThT荧光强度的变化实现对靶标分子的定量检测。在最优实验条件下，3种小分子的检出限分别为0.8 nmol/L (OTA)、1.3 nmol/L (AFB1)和0.1μmol/L (腺苷)。本方法无需标记、操作简单、检测成本低，具有良好的选择性和较低的检出限。进一步开发了基于本方法的检测试剂盒，可用于实际样品中3种生物小分子的检测。

关键词： 全自动固相萃取   高效液相色谱-荧光检测   柱后衍生   黄曲霉毒素B1  

摘要： 采用全自动固相萃取仪，建立适用于粮食中黄曲霉毒素B1的检验方法。样品经提取液提取，用全自动固相萃取-免疫亲和柱净化，采用高效液相色谱-荧光检测（High Performance Liquid Chromatography-Fraunhofer Line Discriminator，HPLC-FLD）柱后衍生法进行测定。结果表明，黄曲霉毒素B1在0.1～20.0 ng·mL-1线性良好，R2为0.999 987；检出限和定量限分别为0.03 μg·kg-1和0.1 μg·kg-1；3水平加标回收率为84.9%～88.5%。本方法自动化程度高、重现性好，可以满足粮食中黄曲霉毒素B1测定的要求。

关键词： 黄曲霉毒素B1   噬菌体展示技术   全合成纳米抗体库   优化   分子对接  

摘要： 真菌毒素是由不同真菌种类产生的次生代谢物,主要是曲霉、赤霉、镰刀菌和青霉。据联合国粮食及农业组织（FAO）报道,世界上25%的食物受到真菌毒素污染。然而,最近的一项研究表明,全世界60～80%的作物受到真菌毒素的感染,这一数字超过了粮农组织给出的数字。曲霉属包括4个亚属339种。曲霉产生的真菌毒素被称为黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是由各种类型的曲霉,特别是黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢物,具有较强致癌作用。目前已经分离鉴定出来的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种,其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的毒性作用最强,被世界卫生组织的国际癌症研究机构（ARC）划分为Ⅰ类致癌物质。为了避免AFB1的污染风险,几乎世界上所有的国家和地区都制定了AFB1的强制限量标准。为了避免受到黄曲霉毒素B1的污染,检测所有食物中AFB1的含量显得特别重要。当前有很多检测技术可应用于检测AFB1,主要包括理化分析方法和免疫学方法等。其中,免疫学方法由于其精确度高,特异性强,操作简便等优点被广泛地用来检测AFB1,但它需要高灵敏度和特异性的抗体。随着分子生命工程的持续发展,重组抗体特别是单链抗体（Single chain Fv antibody fragment,Sc Fv）由于其易于改造、批次间差异小、制备时间短和表达量高等优点成为研究板块。但是,单链抗体与其亲本单克隆抗体相比,亲和力较低此外稳定性较差,从而导致在应用上具有局限性。研究抗原抗体间的不同反应,阐明单链抗体亲和力的影响机制,可为在基因水平上改造单链抗体,进一步提高其亲和力提供理论指导。本研究通过全合成噬菌体展示库筛选制备黄曲霉毒素B的纳米抗体,进一步结合计算机辅助建模设计实现抗体优化,主要内容及实验结果如下:（1）基于噬菌体展示技术利用实验室前期建成的全合成抗体库筛选制备黄曲霉毒素B1抗体基因G5,在此基础上对其进行表达,以期获得大量与AFB1结合的单链抗体,随后通过创建表达载体,再将修饰表达载体转化至感受态细胞BL21（DE3）中,进行诱导后获得可翻译的蛋白即纳米抗体,用于生物活性的鉴定实验。ELISA检测分析G5对AFB1-BSA的结合率以及AFB1对G5结合的抑制率,综合分析抗体亲和力。结果表明,G5对AFB1-BSA的EC约为0.95μmol/LAFB1与抗体竞争结合AFB1-BSA的IC约为43μmol/L,亲和力较好。（2）考虑到G5可能存在亲和力不高、特异性不强的问题,提出了一种基于计算机引导的同源建模和分子对接的体外亲和力成熟方法来优化抗体,通过计算机辅助搜寻目标序列同源建模模板、再进行目标序列与同源模板的多重序列比对,同时对同源模型的构建和模型评估、优化,最终获得一个可靠的三维结构。从抗体-抗原复合结构上来看,根据该试验构建模型G5与AFB1的分子对接,进行相互作用力分析。对接结果按照复合物能量值排序,能量越低表明该结构越稳定。通过打分,最佳G5-AFB1复合物能量分值为-6.29 kcal/mol。G5-AFB1复合物结构选择单链抗体的互补决定区（Complementarity Determining Regions,CDRs）区进行分析,AFB1与纳米抗体结合的氨基酸残基位点为:TYR103、VAL102、ARG101、ILE51、THR52、THR58,并且AFB1与残基ARG101形成较稳定的氢键网络体系。其中氢键键长越短,作用力越强;同时还与残基TYR103、VAL102、ILE51、THR52、THR58形成了疏水作用。再通过Py Mol可视化分析复合物5A内的氨基酸残基,选择最合适的残基ARG101进行突变,突变为IEL101,利用重叠延伸（genesplicingbyoverlapextension PCR,SOE PCR）获得突变基因及其对应的蛋白G5-1,经目的蛋白经纯化后,EC50值为0.196μmol/L,亲和力提高了9倍;IC50值为10.27μmol/L,抑制率提高了4倍,证明优化目的达到。

关键词： 中成药   中药制剂   质量标准   均一性   均一化投料  

摘要： 中成药是中医药产业的重要组成部分,也是中医药现代化的重要标志。目前,中成药制剂批间质量稳定性问题成为制约中药产业高质量发展的关键因素之一,投料饮片质量不均一是影响该问题的直接因素。该文就提高中成药投料饮片质量的均一性问题,提出了均一化投料研究方案。分别从均一化对象及前处理、均一化投料操作规程、均一化评价指标的选择、均一化投料算法、均一化投料工艺等方面进行系统阐述,依据关键质控指标作为均一化目标,探讨均一化投料工艺及其质量分析,形成中成药均一化投料示范性工艺策略,以期为推进中成药制剂批间质量一致性研究提供科学依据。

关键词： 黄曲霉毒素B1   胶体金   陈皮   多功能净化柱  

摘要： 目的：探索中药材陈皮黄曲霉毒素B1胶体金快速检测中假阳性的解决方法，以提高准确率。方法：根据中药基质的干扰来源，首次在胶体金快检前处理方法中引入多功能净化柱快速除杂步骤，并结合高效液相色谱法对快检结果进行验证。结果：多功能净化柱净化能排除油脂、色素、蛋白的干扰，在不降低灵敏度的同时显著降低胶体金试纸条的假阳性率。考察23种药材共计400批次，假阳性率为2%，假阴性率为0。结论：免疫胶体金法快速检测中药陈皮黄曲霉毒素B1前处理步骤中增加固相萃取除杂步骤的操作简便，结果稳定可靠，可作为解决中药复杂基质胶体金快检假阳性的方案。