关键词:
HBV
树鼩
动物模型
TLR-4
IL-6
摘要:
目的通过对新生树鼩接种中、高滴度的人HBV血清,建立树鼩乙肝动物模型;观察树鼩感染HBV后体内相关免疫因子TLR-4和IL-6的动态变化,初步探讨HBV感染的免疫机制。方法第一部分用中、高滴度的人HBV血清接种新生树鼩,建立新生树鼩乙肝动物模型。将新生树鼩随机分组,中滴度组接种含人HBV血清(104-106IU/ml),高滴度组接种含人HBV血清(107IU/ml),对照组不接种。从接种后第8周开始,每隔2周经股静脉采血1次,接种后12周开始,每3个月行肝活检术取肝组织。ELISA法检测血清中HBs Ag的表达,荧光定量PCR(探针法)检测肝组织与血清中HBVDNA含量,免疫组化观察肝组织中HBs Ag表达情况。第二部分观察成功感染HBV的动物体内TLR-4与IL-6的动态变化。将第一部分实验中HBs Ag和(或)HBVDNA阳性树鼩确定为感染组,6只未接种且经检测HBs Ag和HBVDNA均为阴性的树鼩为对照组。ELISA检测两组动物血清中TLR-4与IL-6的表达情况,荧光定量PCR检测两组动物肝组织中TLR-4与IL-6的m RNA水平表达情况,免疫组化法观察两组动物肝组织中TLR-4与IL-6的表达情况。结果第一部分共有34只新生树鼩接种人HBV血清,高滴度组(107IU/ml)与中滴度组(104、105、106IU/ml)各17只动物。结果如下:(1)血清HBs Ag结果:在观察期内(8周4周)高滴度组共检测到8只动物出现HBs Ag阳性(8/17,47.05%),中滴度组和对照组的HBs Ag均为阴性。在8只阳性的动物中,有7只动物在第8周即可检测出HBs Ag阳性,1只动物在22周第一次检测到HBs Ag阳性,且其中5只动物在整个观察期内(8周4周)HBs Ag持续阳性,最长可持续到第48周。(2)血清HBVDNA结果:按照临床检验标准,我们将HBVDNA≥500IU/ml定为阳性标准。在观察期内(8周4周),高滴度组有11只动物血清检测出HBVDNA阳性(11/17,64.7%),中滴度组有5只可检测出HBVDNA,但其拷贝数均低于阳性标准,对照组血清HBVDNA均为阴性。大部分阳性动物在第8周即可检测出,持续时间最短14周最长可达72周。11只阳性动物HBVDNA水平多在103IU/ml左右,少数可达到104IU/ml,随时间的延长,HBVDNA载量逐渐下降。(3)肝组织HBVDNA结果:高滴度组12周与24周肝组织检测都有12只动物出现HBVDNA阳性(12/17,70.5%);中滴度组在第12周有5只检测出HBVDNA阳性(5/17,29.4%),24周有3只检测出HBVDNA阳性(3/17,17.6%),对照组肝组织未检测出HBVDNA阳性。高滴度组阳性动物HBVDNA水平多在103~104IU/ml左右,少数可达到105IU/ml,中滴度组阳性动物HBVDNA水平多在103IU/ml左右。(4)免疫组化结果显示,高滴度组与中滴度组大部分动物肝组织HBs Ag呈阳性表达,高滴度组肝组织HBs Ag阳性动物为12只(12/17,70.5%),中滴度组肝组织HBs Ag阳性动物为5只(5/17,29.4%),对照组染色均为阴性。阳性染色物为棕黄色,主要表达于肝细胞浆和细胞膜。第二部分将第一部分实验中12只HBs Ag和(或)HBVDNA阳性树鼩确定为感染组,6只未接种且经检测HBs Ag和HBVDNA均为阴性的树鼩为对照组。两组动物体内TLR-4与IL-6检测结果如下:(1)ELISA检测感染组与对照组血清中TLR-4结果显示,感染组动物血清中TLR-4的表达在第8w、12w、16w、20w、24w均比对照组高,差异均有统计学意义(p<0.05),随时间的延长,血清TLR-4的表达呈降低趋势。感染组动物血清中IL-6的表达在8w、12w、16w、20w、24w均比对照组高,在第8w、12w、16w有显著性差异(p<0.05),随时间的延长,血清中IL-6表达稍有下降。(2)q RT-PCR检测树鼩肝组织中TLR-4、IL-6m RNA的表达结果显示,感染组TLR-4 m RNA在12周、24周肝组织中的表达水平均比对照组高,差异均具有统计学意义(p<0.05);感染组IL-6m RNA在12周、24周肝组织中的表达水平均比对照组高,第12周有显著性差异(p<0.05)。(3)免疫组化观察TLR-4在感染组中阳性表达率为(10/12,83.3%),在对照组中阳性表达率为(1/6,16.6%),感染组与对照组间差异具有统计学意义(p<0.05)。IL-6在感染组中阳性表达率为(9/12,75%),在对照组中阳性表达率为(1/6,16.6%),感染组与对照组间有显著性差异(p<0.05)。结论1.高滴度(107I